2007-02-15
org.kosen.entty.User@3a444bbb
이현정(endeavor821)
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안녕하세요
실험하다가 안 풀리는 점이 있어 이렇게 글 남깁니다.
다름이 아니라 현재 cloning을 진행 중인데요... ligation이 제대로 안 되는 것 같아요..
insert 자체내에 문제가 있는건지, 아님 정말 다른 문제가 있어 제대로 안되는 건지 알고 싶습니다.
제가 실험함에 있어 문제가 된다고 생각하는 것이 insert 사이즈가 vector size보다 훨씬 큽니다. 그래서 ligation이 안 되는 건지..
insert size = 3.4 kb vector size = 2.7 kb
암튼 해결방안을 좀 부탁드릭겠습니다.
좋은 명절 되세요^^
- cloning
- 문제점 해결
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
윤재영님의 답변
2007-02-16- 0
언급한 내용은 분자 생물학 실험에 있어서 매우 기본적인 내용입니다. 많은 종류의 참고문헌이 이러한 실험에 대해서 매우 자세하게 기술을 하고 있읍니다. 그러나 참고문헌에 나와 있지 않은 경험적인 측면들이 실험 결과의 성패를 좌우 하기도 합니다. 질문하신 분이 처한 어려움은 분자생물학을 대부분의 사람들이 겪었던 어려움이라 생각합니다. 실험 과정을 참고 문헌과 함께 하나하나 복기하면서 뭐가 문제였는지 분석해보면 답을 찾을 수 있을 것입니다. 바로 옆에서 하나하나 손잡고 가르쳐주는 선배가 있지 않은 한은, 글로서 설명하기에는 막연하기도 하려니와, 쉽지도 않습니다. 만일 주위에 이러한 선배가 없자면, 본인의 실험 과정을 최대한 자세하게(아마도 생각하는 것 이상으로) 정리하여 올려야만 원하는 수준의 답을 얻을 수 있을 것입니다. 참고로 저의 경우는 너무나 당연한 부분의 실수를 많이 하였던 경험이 있었고, 이를 극복하기 위해서는 대조군의 시료를 가지고 한단계 한단계 검증하면 실험을 진행했었습니다. 반복하고 인내하면서 자신의 기술로 만들 수 밖에 없는 것이 분자 생물학의 영역입니다. 참고로 그 정도 크기의 insert는 ligation에 전혀 문제가 되지 않습니다. 제한 효소나 탈인산화효소가 제대로 처리 되었다면, insert와 vector의 molar ratio에 대한 고려가 매우 중요합니다. 저의 경우는 보통 크기는 무시하고 3:1의 비율로 반응을 실시했으나, insert의 크기나 실험자의 개인적인 취향이 많이 작용합니다. 또한 전기영동으로 ligation 여부를 확인하는 것도 중요하지만, 형질전환을 ？해서 실험 결과를 확인하시기 바랍니다. 마지막으로, 멸균증류수의 신선도 및 DNA의 순도도 많은 영향을 미치는 것을 경험했었습니다. >안녕하세요 > >실험하다가 안 풀리는 점이 있어 이렇게 글 남깁니다. > >다름이 아니라 현재 cloning을 진행 중인데요... ligation이 제대로 안 되는 것 같아요.. > >insert 자체내에 문제가 있는건지, 아님 정말 다른 문제가 있어 제대로 안되는 건지 알고 싶습니다. > >제가 실험함에 있어 문제가 된다고 생각하는 것이 insert 사이즈가 vector size보다 훨씬 큽니다. 그래서 ligation이 안 되는 건지.. > >insert size = 3.4 kb vector size = 2.7 kb > >암튼 해결방안을 좀 부탁드릭겠습니다. > >좋은 명절 되세요^^ -
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김성학님의 답변
2007-02-16- 0
제 생각에는... 몇가지 중요 point는 1. 제한효소가 잘 working했는지... (Checklists: DNA purification정도(EtOH가 조금이라도 있으면 안됨), double cut일 경우 두 개다 잘 working 했는지, 주로 insert가 잘 안 잘리는데 대안으로 TA cloning해서 자르면 휠씬 더 잘 효소가 잘 working합니다) 2. gel elution gel elution할 때 UV plate위에서 하지 말라는 것입니다. 조금이라도 쬐어 주면 ligation이 잘 안되는 경우가 있습니다. 이경우는 lane을 1:마커 2: elution할 sample 소량, 마지막 lane: sample 모두, 이렇게 하여 running한 다음 1,2 lane만 잘라 크기 확인하고 sample을 자르는 것입니다. >안녕하세요 > >실험하다가 안 풀리는 점이 있어 이렇게 글 남깁니다. > >다름이 아니라 현재 cloning을 진행 중인데요... ligation이 제대로 안 되는 것 같아요.. > >insert 자체내에 문제가 있는건지, 아님 정말 다른 문제가 있어 제대로 안되는 건지 알고 싶습니다. > >제가 실험함에 있어 문제가 된다고 생각하는 것이 insert 사이즈가 vector size보다 훨씬 큽니다. 그래서 ligation이 안 되는 건지.. > >insert size = 3.4 kb vector size = 2.7 kb > >암튼 해결방안을 좀 부탁드릭겠습니다. > >좋은 명절 되세요^^ -
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정철웅님의 답변
2007-02-16- 0
insert가 큰 경우 vector와 입장을 바꿔서 해보시기 바랍니다. 즉 오히려 vector 양을 증가시켜서 해보시기 바랍니다. 제 경우 4kb가 넘는 insert를 그런 식으로 해결했었습니다. >안녕하세요 > >실험하다가 안 풀리는 점이 있어 이렇게 글 남깁니다. > >다름이 아니라 현재 cloning을 진행 중인데요... ligation이 제대로 안 되는 것 같아요.. > >insert 자체내에 문제가 있는건지, 아님 정말 다른 문제가 있어 제대로 안되는 건지 알고 싶습니다. > >제가 실험함에 있어 문제가 된다고 생각하는 것이 insert 사이즈가 vector size보다 훨씬 큽니다. 그래서 ligation이 안 되는 건지.. > >insert size = 3.4 kb vector size = 2.7 kb > >암튼 해결방안을 좀 부탁드릭겠습니다. > >좋은 명절 되세요^^