2007-03-06
org.kosen.entty.User@56f41873
양경미(yakm)
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클로닝을 하는데, Insert의 양 site를 Pme I으로 cut후 Bgl II linker(5'd(pCAGATCTG)3'를 ligation한 후 purify하여 Bam HI으로 cut한 vector에 ligation하려고 합니다.
만일 linker를 사용할 경우 frame을 맞추는데 신경을 쓰지 않아도 되는지요.또한 linker가 insert의 양 site에 붙는 방식으로 ligation되는 거지요..또한 phosphorylated linker와 nonphosphorylated linker는 어떤점이 다른지 ...어떻게 그별해서 쓰는지 ...사용해 보신분들의 조언을 바람니다.
- Bgl ll linker
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답변 3
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답변
한재석님의 답변
2007-03-07- 0
첫번째 질문에 대해 답을 드리면, linker의 경우 주로 blunt end로 ligation이 되기때문에 frame을 맞추는데 신경을 쓰지 않으셔도 되겠죠. linker가 insert에 ligation되는 것은 blunt end ligation입니다. 따라서 pme I으로 cutting후 linker로 ligation했다면 양쪽 끝에 linker가 붙겠죠. phosphorylated된 linker라 하면, polynucleotide의 5' hydroxyl terminus에 인산화 된 oligomer입니다. 이 인산기는 ligation에 꼭 필요한 부분으로서, 이것이 없는 oligomer는 kinase로 인산화 시킨후 사용하셔야 정상적으로 ligation이 됩니다. self ligation을 막으려고 phophatase를 사용하는 것과 같은 이치입니다. 한가지 의문이 있는데 왜 Bgl II liner를 사용하시고 벡터를 BamH I으로 자르시는지요? BamH I linker를 쓰시면 되지 않나요? 아뭏든 도움이 되셨기 바랍니다. >클로닝을 하는데, Insert의 양 site를 Pme I으로 cut후 Bgl II linker(5'd(pCAGATCTG)3'를 ligation한 후 purify하여 Bam HI으로 cut한 vector에 ligation하려고 합니다. >만일 linker를 사용할 경우 frame을 맞추는데 신경을 쓰지 않아도 되는지요.또한 linker가 insert의 양 site에 붙는 방식으로 ligation되는 거지요..또한 phosphorylated linker와 nonphosphorylated linker는 어떤점이 다른지 ...어떻게 그별해서 쓰는지 ...사용해 보신분들의 조언을 바람니다. > > -
답변
양경미님의 답변
2007-03-07- 0
왜냐면, Bgl II linker를 ligation한 후 Bgl II enzyme으로 cut해야 하는데, insert안에 Bam HI site가 있어서입니다. 이렇게 하면 성공할수있겠지요? -
답변
한재석님의 답변
2007-03-07- 0
Bgl II linker를 쓰시는 이유가 Bgl II enzyme을 이용하여 cloning하시려는 게 아닌지요? 만약 inser내에 BamH I이 있다면 왜 굳이 Bgl II enzyme을 쓰시는 지요? >클로닝을 하는데, Insert의 양 site를 Pme I으로 cut후 Bgl II linker(5'd(pCAGATCTG)3'를 ligation한 후 purify하여 Bam HI으로 cut한 vector에 ligation하려고 합니다. >만일 linker를 사용할 경우 frame을 맞추는데 신경을 쓰지 않아도 되는지요.또한 linker가 insert의 양 site에 붙는 방식으로 ligation되는 거지요..또한 phosphorylated linker와 nonphosphorylated linker는 어떤점이 다른지 ...어떻게 그별해서 쓰는지 ...사용해 보신분들의 조언을 바람니다. > >