2007-03-07
org.kosen.entty.User@279b213d
배형우(genetic99)
- 2
안녕하세요.
제가 원하는 gene을 vector에 붙여서 cell line에 transfection을 시켰습니다.
그리고 항생제인 G418을 처리하여 stable한 cell line을 만들었습니다. 그리고 cell안에서 제가 넣어 준 gene이 translation을 하는지 알아볼려고 mRNA를 뽑아서 RT-PCR을 해서 cDNA로 만들어준 다음에 제꺼 gene의 특이적인 primer를 이용해서 PCR을 실시 했습니다. 그리고 control로 G418 primer(항생제 gene)로도 PCR을 실시 했습니다. 그런데 PCR후 제꺼 gene은 안보이고 G418 gene 만 보입니다. 그럼 transfection은 된거지요? 그런데 왜 제가 원하는 gene은 안보이는 걸까요?
좋은 조언 부탁드립니다.
- ja
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답변 2
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답변
한재석님의 답변
2007-03-07- 0
stabel cell line을 만드셨다면 transfection은 됐다고 말할 수 있지요. resistant gene이 존재하지 않는다면 selection이 되지 않을 테니까요.하지만 chromosomal integration 과정에서 질문하신 분이 원하시는 gene은 deletion되었다고 말할 수 있을 겁니다. 즉 neomycin resistant gene은 integration이 되었지만 다른 쪽은 host chromosome에 들어가지 않은 것이죠. 이런 문제를 피하기 위하여 Clonal selection 과정에서 되도록 많은 콜로니를 선택해서 각각 원하는 유전자의 발현 정도를 비교해서 하나 또는 그 이상을 선택해야 합니다. 물론 host chromosome에 integration된 위치에 따라서 원하시는 유전자의 발현정도가 달라질 수도 또는 전혀 나타나지 안을 수도 있으므로 항상 여러 콜로니를 선택해서 다시 한번 스크리닝을 하셔야 할 것 같습니다. 적어도 10개 이상의 콜로니를 선택하시는게 좋을 듯 싶습니다. >안녕하세요. >제가 원하는 gene을 vector에 붙여서 cell line에 transfection을 시켰습니다. >그리고 항생제인 G418을 처리하여 stable한 cell line을 만들었습니다. 그리고 cell안에서 제가 넣어 준 gene이 translation을 하는지 알아볼려고 mRNA를 뽑아서 RT-PCR을 해서 cDNA로 만들어준 다음에 제꺼 gene의 특이적인 primer를 이용해서 PCR을 실시 했습니다. 그리고 control로 G418 primer(항생제 gene)로도 PCR을 실시 했습니다. 그런데 PCR후 제꺼 gene은 안보이고 G418 gene 만 보입니다. 그럼 transfection은 된거지요? 그런데 왜 제가 원하는 gene은 안보이는 걸까요? >좋은 조언 부탁드립니다. -
답변
박대성님의 답변
2007-03-09- 0
안녕하세요? 어렵게 진행한 실험결과가 만족스럽지 못해 난감하시겠어요. 일단 항생제 처리하여 선별한 clone 몇개를 더 test해 보시는게 좋겠습니다. 제가 이분야의 전문가는 아니지만, stable transfection 확인방법에서 말씀드리고 싶은 것은 chromosome상에 plasmid DNA가 integration 되었냐와 목적하는 유전자가 발현하느냐는 별개로 확인하셔야 할 것입니다. 즉, transfection에 사용된 plasmid DNA가 제대로 chromosome상에 integration 되어 G418 resistant gene (Neor)이 발현하더라도 목적하는 유전자가 어떤 이유로 mRNA 전사가 안될 가능성도 있습니다. 이 경우, RT-PCR로 목적하는 유전자의 발현유무를 검증한다면 당연히 negative한 결과가 나올 것입니다. 그럼, transfection 과정에서 목적하는 유전자만 deletion되었을 가능성도 생각할 수 있는데... 그것은 해당 stable cell 후보 클론에서 genomic DNA를 분리하여 그것을 주형으로 plasmid에 넣었던 원하는 유전자 증폭용 primer로 PCR해 보시면 확인하실 수 있을 겁니다. 아울러, 제작하신 plasmid vector에서 원하는 유전자 삽입이 제대로 되었는지 확인해 보실 필요도 있는 것 같습니다. 위에 말씀드린 내용은 발현벡터로 목적한 유전자 클로닝을 수행한 단계에는 전혀 문제가 없었다는 전제가 깔려있기 때문입니다. 제한효소 처리로만 확인하지 마시고 발현벡터 multicloning site 양쪽에 존재하는 sequencing primer-binding site에 합당한 primer (보통의 경우, T7과 3'BGH)로 목적하는 유전자의 양말단을 반드시 확인해 보시길 권장합니다. 그럼 조금이나마 도움이 되었길 바라며... >안녕하세요. >제가 원하는 gene을 vector에 붙여서 cell line에 transfection을 시켰습니다. >그리고 항생제인 G418을 처리하여 stable한 cell line을 만들었습니다. 그리고 cell안에서 제가 넣어 준 gene이 translation을 하는지 알아볼려고 mRNA를 뽑아서 RT-PCR을 해서 cDNA로 만들어준 다음에 제꺼 gene의 특이적인 primer를 이용해서 PCR을 실시 했습니다. 그리고 control로 G418 primer(항생제 gene)로도 PCR을 실시 했습니다. 그런데 PCR후 제꺼 gene은 안보이고 G418 gene 만 보입니다. 그럼 transfection은 된거지요? 그런데 왜 제가 원하는 gene은 안보이는 걸까요? >좋은 조언 부탁드립니다.