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>glycosylated protein에 대한 sandwich elisa를 하려고 계획중입니다>이때 사용하는 coating antibody와 detect antibody가 둘다 monoclonal antibody인거랑 mono랑 poly로 조합한 거랑 어떤 게 더 좋은가요?>그리고 antibody가 glycosylation된 단백질을 면역원으로 사용하지 않고 얻어진 것을 사용해도 괜찮을까요? The following is a general protocol for a sandwich (capture) ELISA . The precise conditions should be optimized for a particular assay. Solution Preparation Coating Solution: Antigen or antibody are diluted in coating solution to immobilize them to the microplate. Commonly used coating solutions are: 50 mM sodium carbonate, pH 9.6; 20 mM Tris-HCl, pH 8.5; or 10 mM PBS, pH 7.2. A protein concentration of 1-10 ？g/ml is usually sufficient. Blocking Solution: Commonly used blocking agents are: BSA, nonfat dry milk, casein, gelatin, etc. Different assay systems may require different blocking agents. Primary/Secondary Antibody Solution: Primary/secondary antibody should be diluted in 1X blocking solution to help prevent non-specific binding. A concentration of 0.1-1.0 ？g/ml is usually sufficient. Antigen Solution: Sample antigen should be diluted in 1X blocking solution to help prevent non-specific binding. A concentration of 0.1-1.0 ？g/ml is usually sufficient. Wash Solution: Typically 0.1 M Phosphate-buffered saline or Tris-buffered saline (pH 7.4) with a detergent such as Tween 20 (0.02%-0.05% v/v). Protocol Apply Capture Antibody 1. Add 100 ？l capture antibody diluted in coating solution to appropriate wells. 2. Incubate 1 hour at room temperature. 3. Empty plate and tap out residual liquid. Block Plate 1. Add 300 ？l blocking solution to each well. 2. Incubate 5 minutes, empty plate and tap out residual liquid. React Sample Antigen 1. Add 100 ？l diluted antigen to each well. 2. Incubate at room temperature for 1 hour to overnight. 3. Empty plate, tap out residual liquid. Wash Procedure 1. Fill each well with wash solution. 2. Invert plate to empty, tap out residual liquid. 3. Repeat 3 to 5 times. Add Secondary Antibody Solution 1. Add 100 ？l diluted secondary antibody to each well. 2. Incubate 1 hour at room temperature. 3. Empty plate, tap out residual liquid and wash as in step 4. 4. Give final 5 minute soak with wash solution; tap residual liquid from plate. React Substrate 1. Dispense 100 ？l substrate into each well. 2. If desired, after sufficient color development add 100 ？l of the appropriate stop solution to each well. 3. Read plate with plate reader. Suggested filters for KPL Substrates: ABTS: 405-410 nm TMB: non-stopped 620-650 nm, stopped 450 nm OPD: non-stopped 450 nm, stopped 490 nm pNPP: 405-410 nm BluePhos？: 595-650 nm References: Perlmann, H. and Perlmann, P. (1994). Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. In: Cell Biology: A Laboratory Handbook. San Diego, CA, Academic Press, Inc., 322-328. Crowther, J.R. (1995). Methods in Molecular Biology, Vol. 42-ELISA: Theory and Practice. Humana Press, Totowa, NJ. Harlow, E. and Lane, D. (1988). Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 553-612.

결국 모든 에세이는 sensitivity와 specificity의 정도가 최종적으로 원하는 결과를 좌우합니다. 일반적으로 mono를 쓰면 specificity가 증가하고 poly를 쓰면 sensitivity가 증가합니다. 조금 쉽게 Western을 예를 들어 설명한다면, mono를 쓰면 Western 시 하나의 밴드가 나타나는 반면, poly를 쓰면 하나 이상이 나올 가능성이 높아진다고 할 수 있겠죠.. 많은 경우에 어떤 것이 더 좋다라고 하기는 힘듭니다.. mono를 선호하는 이유 중 하나가 많은 에세이에서 우리가 보고자 하는 것은 specificity입니다.. 이때 sensitivity가 높다면 더 좋겠죠.. 따라서 페이퍼를 쓸때 mono를 선호하는 이유가 바로 이것 때문이구요.. glycosylation된 단백질을 면역원으로 사용하지 않고 얻어진 항체를 쓴다면.. 보고자 하는 것이 glycosylation이 되었느냐가 중요하지 않다면 일단은 상관이 없을 수 있습니다.. 하지만 ELISA는 Western에서처럼 denaturation을 시키지 않기 때문에 natural 한 상태에서의 non-glycosylation이 3-D에 미치는 영향에 따라 결과가 달라질 수 있을 것 같습니다.. 좋은 실험 되세요.. >glycosylated protein에 대한 sandwich elisa를 하려고 계획중입니다 >이때 사용하는 coating antibody와 detect antibody가 둘다 monoclonal antibody인거랑 mono랑 poly로 조합한 거랑 어떤 게 더 좋은가요? >그리고 antibody가 glycosylation된 단백질을 면역원으로 사용하지 않고 얻어진 것을 사용해도 괜찮을까요?

>glycosylated protein에 대한 sandwich elisa를 하려고 계획중입니다 >이때 사용하는 coating antibody와 detect antibody가 둘다 monoclonal antibody인거랑 mono랑 poly로 조합한 거랑 어떤 게 더 좋은가요? 직접적인 비교는 힘듭니다. antigen과 사용하는 antibody의 특성에 따라 case-by-case이기 때문이죠... 정답은 background noise signal이 매우 낮고 (적어도 0.2 이하), true signal이 높은 조합이 가장 이상적인 조합이죠 Mono-Mono combination일 경우 detection ab에 효소가 바로 붙어 있으면 큰 문제가 안될 수 있습니다. 만약 enzyme-conjugated secondary anbody를 사용하게 된다면 이 ab가 capture ab에 직접 결합할 수 있으므로 사용하기 힘들겠지요... 물론 detection ab를 biotinylation시켜 streptavidin-enzyme system을 사용한다면 가능합니다. 이게 힘들다면 mono-poly 조합이 좋겠지요... 일반적인 개념은 capture ab는 sensitivity에 detection ab는 specificity에 중점을 둡니다. >그리고 antibody가 glycosylation된 단백질을 면역원으로 사용하지 않고 얻어진 것을 사용해도 괜찮을까요? 이것 또한 해봐야 하는데 carbohydrate moiety가 ab의 recognition을 얼마나 interfering하느냐에 달려있겠죠... 즉 carbohydrate에 의한 steric hindrance가 ag-ab interaction을 방해하느냐 하지 않느야이니 해봐야 알 수 있습니다.

>glycosylated protein에 대한 sandwich elisa를 하려고 계획중입니다 >이때 사용하는 coating antibody와 detect antibody가 둘다 monoclonal antibody인거랑 mono랑 poly로 조합한 거랑 어떤 게 더 좋은가요? >그리고 antibody가 glycosylation된 단백질을 면역원으로 사용하지 않고 얻어진 것을 사용해도 괜찮을까요? 어떤 항체가 됐던지간에.. 잡으려고하는 glycosylation된 단백질을 항원으로 사용하지않았다면,, 얻으신 항체에 glycosylation된 region을 인식하는 항체가 없을 것이기 때문에 glycosylation된 단백질을 정량하기는 어려울 듯 싶습니다. 지금과 같이 특정 부위가 modification된 것을 비교하신다면, polyclonal Ab로 capture하시고, glycosylation된 region에 대한 특이 항체를 만드셔서 detection에 사용하시는 것이 좋을 것 같습니다. glycosylation된 region 특이적인 항체는 glycosylation된 단백질이나 펩타이드를 면역하셔서 serum을 얻으신 후 일반 단백질, glycosyaltion된 단백질을 이용한 affinity resin으로 dual purification해 얻으시거나, mono로 만든 후 일반단백질은 안잡고 glycosylation된 것만 잡는 clone을 selection하시면 될 것입니다. 그리고 검출하실때에는 2차 항체를 이용하는 것 보다 (species간의 specificity가 떨어지는 항체들이 많아 background가 꽤 큽니다) direct lableing하시거나 biotinylation해서 사용하시면 좋을 것입니다.