KOSEN 한인과학기술자네트워크

고민 많이 하시고, 글을 남기신것같네요~ ^^ 일단 colony PCR은 cloning screening 방법중 극히 하나일 뿐입니다. 님께서 cloning하신후 prep하여 enzyme으로 digenstion하기전에 미리 cloning이 되었는지 확인하는 방법이지요. 또한 colony PCR은 bacterial genomic DNA contamination이 있을 수 있기 때문에 이론처럼 PCR이 안되는 경우도 더러 있답니다. 즉 nonspecific band가 뜨기도 한다는 말씀~~ 그래서!!! colony PCR 때문에 너무 고민하시지 마시구요~ enzyme으로 digestion한 후 sequencing하여 cloning screening을 마무리하세요. 또 님께서 사용한 PCR primer pair가 Tm 값이라든지 self anealing이 라든지하는 것들이 고려되지 않기 때문에 세band가 나오는 수 있는 겁니다. 어디서 오는 nonspecific band 일지는 모르나.. 고민하시지 마시구요~ negative control에도 동일하게 나오는지 확인하세요~ (negative control: insert 없이 vector만 ligation한 only vector를 말합니다.) 그리고 enzyme digestion해보세요~ cloning된 게 맞다면 cloning한 enzyme 으로 처리했을때 insert가 release될테니까요~ ^^ Let's go!!!! ^^ >안녕하세요. > >실험하다가 궁금한게 있어 이렇게 글 올립니다. > >다른게 아니라 제가 요즘 cloning을 하고 있는데요... >생각보다 쉽지가 않네요... >일단은 제 상황을 설명 해드릴게요. > >Lentivirus를 transfection 할 수 있게 일차적으로 pENTR4 vector(2.7kb)를 사용합니다. >그리고 insert는 pGRN145 vector내에 존재하는 hTERT를 이용합니다. > >hTERT(ATCC에서 구입)의 경우 pGRN145 vector의 MCS 내에 존재하며 이를 이용해 hTERT(약 3.4kb)만 잘라 vector로 Insertion 하려고 합니다. > >허나 잘 안되요.... 처음엔 vector보다 insert 사이즈가 커서 잘 안되나 싶었는데 지금은 그게 전부는 아닌 것 같습니다. > >현재 ligation 샘플을 tranformation 하여 얻은 colony를 colony PCR을 통해 insert의 유무를 확인합니다. >그런데 여기서 자꾸 문제가 생겨요... > >insert 사이즈의 한 밴드가 나와야 하는데 그게 아니라 그보다 작은 세가지 밴드가 나오더군요. 몇번의 실험결과 계속해서 같은 결과가 나왔습니다. 혹시나 하는 마음에서 이를 prep하여 enzyme digestion하여 확인한 결과 vector 사이즈만 확인되었습니다. > >그래서 제가 무엇을 놓치고 있는 것 같다는 생각이 들어 colony PCR 할때 사용한 primer에 문제가 있는게 아닐까 생각이 들어 사용한 primer를 다시 찾아봤습니다. > >그 결과, colony PCR할때 사용한 Primer.... > >정방향으로는 hTERT의 full sequence에서 처음 600bp 정도를 건너 뛴 그 다음부터 읽는 primer를 사용했습니다. 이 Primer는 hTERT의 seqencing을 하기 위해 full sequence를 여러 부분으로 나누어 제작한 Primer 중 하나였습니다. 이것을 제가 간과했더라구요.. > >hTERT의 CDS 59-3457 인데 제가 사용한 정방향의 Primer는 59bp에서부터 시작하는게 아니라 661번부터 짜여져 있었습니다. (약20mer) > >그리고 역방향으로는 pENTR4 Vector의 reverse primer를 사용하였습니다. > >여기까지 내용을 정리하자면, 정방향의 Primer가 붙는 부분이 hTERT의 개시코돈부터 시작되는게 아니라서 PCR을 했을때 hTERT의 full sequence의 길이가 나오는게 아니란 걸 알게 되었다란 사실입니다. 허나 여기서 의문이 생기는데요... > >그럼 이 sequencing primer로 Colony PCR을 했을때 확인할 수 있는 Insert의 크기는 insert의 개시코돈부터 정방향 sequencing primer가 붙는 위치 사이의 크기만큼 빠지고 그 이후의 길이가 나와야 되는거 아닌가요?? > >즉, 전체 hTERT의 길이 3.4 kb - 약 600bp = 약 2.8kb >여기서, 600bp는 hTERT의 >CDS의 660에서 59를 뺀 차이값입니다. > >위 계산대로 약 2.8kb가 나와야 하는거 아닌가요?/ > >제가 뭘 잘못 생각하고 있는 건지 궁금합니다. 잘못된게 있으면 바로 잡고 싶어요... > >vector와 insert의 contamination을 고려해보지 않은 것도 아닙니다. >여러 번의 elution으로 조심해서 했음에도 불구하고 같은 결과가 나오는 걸 보아 오염의 문제는 아닌 것 같고 primer와 상관이 있는 것 같은데 도저히 전 모르겠네요... > >꼭 문제점을 찾고 싶어요.. > >상당히 길게 썼는데 여기까지 읽어 주심에 감사하고.. 답변 꼭 부탁 드리겠습니다.