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그람 염색법에 사용되는 crystal violet맞습니다 아래 그람 염색법에 관한 내용 한번 읽어보시기 바랍니다. 그리고 산세포에 확인되는 이유는 오래된 죽은 세포는 잘못된 염색결과를 가져오는 경우가 많으므로 crystal violet결과로 제대로 된 염색이 되는 경우는 세포가 살아있다고 확인한다고 합니다 그람염색 [Gram's stain] 1884년 덴마크의 의사 Hans Christian Gram(1853∼1938)이 고안한 특수 염색법으로, 표본을 아닐린수(水)·겐티아나액(液)으로 물들여서 요오드·요오드화 칼륨액으로 처리한 후, 순(純)에탄올로 씻으면, 조직은 탈색되지만 균은 탈색되지 않고 자주색으로 보인다. 그러나 그후 여러 가지 균종이 발견되자 그 속에는 조직과 마찬가지로 에탄올 세정에 의하여 탈색되는 균도 있다는 것이 밝혀졌다. 이때 탈색되는 균을 그람음성균, 탈색되지 않는 균을 그람양성균이라 부르기로 하면서 이 염색법은 당초의 목표와는 달리 세균의 분류에 이용되기도 하였다. 그후 양성·음성균은 화학요법제에 대한 감수성뿐만 아니라, 균의 증식에 필요한 영양소의 종류, 물리·화학적 자극에 대한 반응, 생산하는 독소, 병변 등 각 방면에서 차이가 있다는 것을 알게 되면서 그람염색법의 의의는 증대하였다. 현재는 염색법도 많이 개량되었는데, 그 표준적인 방법은 다음과 같다. 세균을 슬라이드글라스에 놓고 건조 고정시킨 후 석탄산 겐티아나 자액으로 1∼2분 동안 염색한 후, 경사지게 하여 루고액(液)을 약 1분 동안 작용시킨 다음 무수알코올로 탈색하여 물로 씻은 후 여과지로 물을 흡수시킨다. 다음으로 사프라닌 등의 적색 계통 색소로 1∼3분 동안 염색을 하고 물로 씻어 말린 후에 현미경으로 관찰한다. 그람 염색 술식에 있어 1차로 쓰이는 Crystal violet을 건조, 고정된 세균 도말표본에 가했을 때 그람 양성균이나 그람 음성균 모두 Crystal violet에 착색된다. 이와 같은 현상은 색소의 염기군과 세포의 산성군 사이 일어나는 이온 결합에 의한다. 시약 중의 iodine-potassium iodide액은 매염제(mordant)의 구실을 하는데 그람 양성 및 음성균 세포 내에서 색소와 작용하여 일종의 침체현상을 일으켜 색소의 부착을 촉진한다. 탈색제(decolorizer)는 그람 음성균 세포에 착색된 crystal violet 색을 없애지만 그람 양성균은 위 탈색제에 견딜 수 있어 crystal violet색을 유지하게 된다. 그람염색 과정 중 가장 주의해야 할 점이 탈색제의 사용이며 그 적용 시간이다. 만약 탈색제 적용시간이 지나치기 길면 그람 양성균이 그람 음성균으로 보일 수 있기 때문이다. 마지막으로 후염색소(counter stain)로 쓰이는 safranin O는 일단 탈색된 세균 세포벽에 착색되어 적색으로 보이게 된다. 이와 같은 균종을 그람 음성균이라고 한다. 이때 그람양성균은 자주색으로, 그람음성균은 적색으로 염색된 것을 볼 수 있다. 그람양성균의 종류에는 폐렴균·포도상구균·연쇄상구균·탄저균(炭疽菌)·나병균·디프테리아균·파상풍균 등이 있으며, 그람음성균의 종류에는 콜레라균·페스트균·티푸스균·이질균·대장균·임균·스피로헤타 등의 균종이 있다. 그람염색의 색이 다르게 나타나는 이유는 각 세균의 세포벽을 이루고 있는 성분과 구조 때문이다. 그람양성세균의 경우 세포벽이 두꺼운 peptidoglycan layer와 lipoteichoic acid와 wall teichoic acid로 이루어져 있어서 염색 시 굵은 peptidoglycan 층 안에서 crystal violet과 iodine이 복합체를 형성하여 굵은 입자를 형성한다. organic decolorizer(탈색제)로 탈색시 이 입자들이 세포벽 바깥으로 빠져나오지 못하므로 쉽게 탈색되지 않으며 따라서 염색액 crystal violet이 계속 세균 내에 남아있어 보라색으로 염색된다. 반면 그람음성세균은 peptidoglycan layer가 얇은 단일층으로 되어 있으며 outer membrane이라는 또 하나의 인지질 이중층으로 이루어져 있다. 이 때 peptidoglycan층은 periplasm라고 불리는 여러 효소와 기질이 존재하는 작은 공간이 생기게 된다. 그리고 outer membrane은 지방성분이 풍부한 lipopolysaccharide(LPS)라는 물질로 이루어져 있는데 이들은 강한 음전하를 띠기 때문에 식포작용 등으로부터 세포를 보호하지만 peptidoglycan이 얇기 때문에 물리적으로 손상받기 쉽다. 그렇기 때문에 그람염색을 할 때 알코올에 의해서 outer membrane이 파괴되고 얇은 peptidoglycan의 구멍으로 부터 crystal violet이 빠져나가기 때문에 나중의 대조 염색액인 safranin O로 염색되어 붉은 색을 나타낸다. 이러한 그람양성균과 그람음성균의 세포벽 구조의 차이는 실제적으로 세균을 다루는데 있어서 중요하다. 두꺼운 peptidoglycan층을 가지는 양성균은 물리적인 힘에 대해서는 좀 더 잘 견디나, 가수분해효소인 lysozyme에 의해서는 외부가 지질성 막으로 싸여 있는 음성균의 peptidoglycan보다 더 쉽게 분해된다. 그리고 양성균은 페니실린에 대하여 고도의 감수성을 나타낸다. 왜냐하면 페니실린의 존재 하에서 분열하는 세포의 peptidoglycan 합성효소가 저해를 받아 세포벽이 형성되지 못하기 때문이다. 이렇게 세포벽이 형성되지 못하면 외부에서 유입되는 물에 대항할 수가 없어 세포막이 파괴되고 세균이 파괴된다. 그에 반해, 음성균은 페니실린에 대하여 감수성을 나타내지 않는다.