KOSEN 한인과학기술자네트워크

얼마나 답답하신지 알것같습니다. 일단, enzyme이라는 것이 일정시간이 지나면 activity가 떨어지는 건 아시지요? 제한효소를 자르기위해, 잘 안잘린다고 해서 밤새 incubation하는 것은 아무 의미 없다는 말씀입니다. 한시간을 충분한 양으로 처리했는데 잘 안잘린다면 DNA가 지저분하다던지, 제한효소 activity가 떨어졌다든지.. 다른 이유가 있을겁니다. 그리고 제한효소 처리후 phenol chloloform 처리해서 단백질을 제거하셨는데, 그 부분은 생략하기도 한답니다. (DNA를 너무 많이 잃거든요..) 저희 실험실에서는 님께서 하는 실험을 한다면 이렇게 진행합니다. 1. DNA를 제한효소 EcoRI으로 자른다. 2. complete digestin되었는지 확인한다. (제한효소 처리한 것의 1/10의 양을 젤에 내려보는 방법으로..) 3. enzyme inactivation한다. (65도에서 10분) 4. klenow enzyme으로 filling한다. 5. enzyme inactivation한다. (65도에서 10분) 6. Hind III로 digestion한다. 7. enzyme inactivation한다. (65도에서 10분) 8. CIP/ SAP 처리한다. 9. enzyme inactivation한다. (65도에서 10분) 10. Gel에 전부를 loading하여 Gel elution하여 정량하여 ligation한다. Blunt end는 cohesive end보다 ligation이 잘 안됩니다. 컨디션 잘 맞추시고, 다시한번 진행해보세요~ ^^ 아자아자 힘내세요. 대답이 되었길 바랍니다. ^^ >ligation을 하기 위해서 vector를 준비하고 있는데요.. >사이가 좁아서(50bp) EcoRI을 친 다음에 filling을 해서 blunt로 만든다음 HindIII를 쳐서 >한쪽만 cohesive를 만듭니다. 보통 ligation은 18도에서 o/n하구요 >제가 이때까지 한 방법은 저녁에 EcoRI을 쳐 놓고 (농도가 진하기도 하고 잘 안 잘리는 듯 해서..) 아침에 phenol extract 두번하고 에탄올침전하고, TE buffer로 녹입니다. >그걸 통째 filling을 하고(37도에서 20분 후에 상온 20분) 다시 phenol extract 두번하고 에탄올침전하고, TE buffer로 녹입니다. >그리고 통째 저녁에 HindIII를 친다음 다음날 아침에 gel extract를 하는데요.. >계속 잘 되질 않고 있습니다. >insert도 vector처럼 blunt-cohesive인데 별 문제가 없는 것 같구요 >근데 DNA를 분리해서 잘라보면 암튼 벡터가 문제인 것 같은데... >제대로 FILLING이 안 됐다거나 HindIII가 안 잘렸는지... >문제를 잘 모르겠네요 >cip를 꼭 해야하는지요... >한단계 한단계 거치면서 로스가 많이 일어나서 끝에 gel extract를 할 때는 거의 건지지 못 할 것 같아서요.. >CIP를 한다면 FILLING후에 곧바로 해야하는지 아니면 HindIII로 자른 후에 CIP를 해야하는지.... >정말 답답하네요.... >도움 부탁드립니다. >