2007-06-11
org.kosen.entty.User@6d44dc3e
윤대선(dainsun)
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T 세포를 CD4 맥스 비드를 이용하여 purification 하고, 증식을 시키려고 합니다....
CD3와 CD28 antibody를 이용하여 activation 증식 시키려하구요.....
CD3(10 마이크로g/ml)는 하루전 24well plate에 코팅시키고 나서 다음날 soluble한 CD28(2마이크로g/ml)과 함께 T 세포를 배양합니다.
문제는 증식이 잘 안된다는 것입니다.
아무래도 CD3를 plate에 coating시키는 buffer문제인듯한데요.....
코팅을 위해 Tris-cl(ph 9.5, 0.05M) buffer를 제작하였습니다......
근데 위의 농도는 오토클레이브하기전인데요....
오토클레이브하고 난후에는 따로 ph를 확인하지 않았습니다. 4도씨에 보관을 하였구요.....최근에 새로 만들었습니다.
CD3(10 마이크로g/ml)코팅을 위의 버퍼로 CD3 농도를 맞춰서 16시간 4도씨에 코팅하였습니다....
16시간후 플레이트의 버퍼를 3회 배지로 wash후 CD28을 첨가한 T세포와 배양하였습니다.
자라지 않는 이유는 코팅 버퍼라고 생각되는데.....
지금 다시 버퍼 ph를 재니 9.9가 나왔습니다(4도씨에서 재서 그런듯...다시 상온에서 재니 9.52나오네요)....헐....
이를 어떻게 해야합니까?
오토클레이브를 하지 말아야 하나요?
아님 4도씨에 보관을 하지 말아야 하나요?
오토클레이브를 하고 ph를 맞춰야하나요?
코팅시 상온에서 하는건 어떨런지?
아니면 버퍼 말고 다른곳에 문제가 있나요?
혹은 다른 효율적인 방법으로 CD3를 plate에 binding시키는 방법이 있는지 아시면 좀 알려주시기 바랍니다.... 부탁드립니다.
- T
- proliferation
- cd3
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
강정원님의 답변
2007-06-11- 0
CD3 항체를 PBS에 희석한 후 37도 CO2 incubator에서 1시간만 방치해도 잘 됩니다. 워싱은 따로 안하구요. 분리한 세포는 어떤지 확인해보시고 ConA로 자극해봐서 정말 항체가 문제인지 확인해보시기 바랍니다. >T 세포를 CD4 맥스 비드를 이용하여 purification 하고, 증식을 시키려고 합니다.... >CD3와 CD28 antibody를 이용하여 activation 증식 시키려하구요..... >CD3(10 마이크로g/ml)는 하루전 24well plate에 코팅시키고 나서 다음날 soluble한 CD28(2마이크로g/ml)과 함께 T 세포를 배양합니다. > >문제는 증식이 잘 안된다는 것입니다. >아무래도 CD3를 plate에 coating시키는 buffer문제인듯한데요..... > >코팅을 위해 Tris-cl(ph 9.5, 0.05M) buffer를 제작하였습니다...... >근데 위의 농도는 오토클레이브하기전인데요.... >오토클레이브하고 난후에는 따로 ph를 확인하지 않았습니다. 4도씨에 보관을 하였구요.....최근에 새로 만들었습니다. > >CD3(10 마이크로g/ml)코팅을 위의 버퍼로 CD3 농도를 맞춰서 16시간 4도씨에 코팅하였습니다.... >16시간후 플레이트의 버퍼를 3회 배지로 wash후 CD28을 첨가한 T세포와 배양하였습니다. > >자라지 않는 이유는 코팅 버퍼라고 생각되는데..... >지금 다시 버퍼 ph를 재니 9.9가 나왔습니다(4도씨에서 재서 그런듯...다시 상온에서 재니 9.52나오네요)....헐.... >이를 어떻게 해야합니까? >오토클레이브를 하지 말아야 하나요? >아님 4도씨에 보관을 하지 말아야 하나요? >오토클레이브를 하고 ph를 맞춰야하나요? >코팅시 상온에서 하는건 어떨런지? > >아니면 버퍼 말고 다른곳에 문제가 있나요? > >혹은 다른 효율적인 방법으로 CD3를 plate에 binding시키는 방법이 있는지 아시면 좀 알려주시기 바랍니다.... 부탁드립니다. > > > > -
답변
윤대선님의 답변
2007-06-11- 0
pbs에서 그냥 coating시 plate는 그냥 일반 plate인가요? 궁금합니다... -
답변
강정원님의 답변
2007-06-12- 0
plate는 일반적으로 사용하는 것(Nunc, coring)을 쓰고 있습니다. >T 세포를 CD4 맥스 비드를 이용하여 purification 하고, 증식을 시키려고 합니다.... >CD3와 CD28 antibody를 이용하여 activation 증식 시키려하구요..... >CD3(10 마이크로g/ml)는 하루전 24well plate에 코팅시키고 나서 다음날 soluble한 CD28(2마이크로g/ml)과 함께 T 세포를 배양합니다. > >문제는 증식이 잘 안된다는 것입니다. >아무래도 CD3를 plate에 coating시키는 buffer문제인듯한데요..... > >코팅을 위해 Tris-cl(ph 9.5, 0.05M) buffer를 제작하였습니다...... >근데 위의 농도는 오토클레이브하기전인데요.... >오토클레이브하고 난후에는 따로 ph를 확인하지 않았습니다. 4도씨에 보관을 하였구요.....최근에 새로 만들었습니다. > >CD3(10 마이크로g/ml)코팅을 위의 버퍼로 CD3 농도를 맞춰서 16시간 4도씨에 코팅하였습니다.... >16시간후 플레이트의 버퍼를 3회 배지로 wash후 CD28을 첨가한 T세포와 배양하였습니다. > >자라지 않는 이유는 코팅 버퍼라고 생각되는데..... >지금 다시 버퍼 ph를 재니 9.9가 나왔습니다(4도씨에서 재서 그런듯...다시 상온에서 재니 9.52나오네요)....헐.... >이를 어떻게 해야합니까? >오토클레이브를 하지 말아야 하나요? >아님 4도씨에 보관을 하지 말아야 하나요? >오토클레이브를 하고 ph를 맞춰야하나요? >코팅시 상온에서 하는건 어떨런지? > >아니면 버퍼 말고 다른곳에 문제가 있나요? > >혹은 다른 효율적인 방법으로 CD3를 plate에 binding시키는 방법이 있는지 아시면 좀 알려주시기 바랍니다.... 부탁드립니다. > > > >