2007-06-19
org.kosen.entty.User@3c79e1b4
김재완(gear2c)
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제가 원하는 protein을 immunoprecipition을 해야하는데, 지금 rabbit polyclonal Ab밖에 없어서 IP및 western을 다 이 Ab로 해야합니다. 그런데 이 protein의 크기가 IgG의 light chain과 비슷한 관계로 IP를 하고 난 다음에 western을 할 경우 light chain에 묻히고 맙니다. 그래서 이런경우의 Western을 하기 위해서 이 단백질의 Ab에 biotinylation을 하고 strepavidin-HRP로 잡기로 하였습니다.
biotinylation을 한 후 lysate로 일단 조건을 잡아서 streptavidin의 농도는 1/10000이상이면 매우 clear하게 나옴을 확인하였습니다. 그런데, IP product를 loading하면 이게 heavy or light chain인지 뭔지 모를 Non-specific이 몇개 진하게 나옵니다. streptavidin-HRP를 1/40000까지 낮추어도 나옵니다. streptavidin이 혹시 Ab를 잡나요?? 아니면 무슨 잡밴드일까요?? 왜 이렇게 Non-specific band가 보이는지 고수님들의 조언 부탁드립니다.
- streptavidin
- western
- Immunoglobulin
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윤철희님의 답변
2007-06-20- 0
>제가 원하는 protein을 immunoprecipition을 해야하는데, 지금 rabbit polyclonal Ab밖에 없어서 IP및 western을 다 이 Ab로 해야합니다. 그런데 이 protein의 크기가 IgG의 light chain과 비슷한 관계로 IP를 하고 난 다음에 western을 할 경우 light chain에 묻히고 맙니다. 그래서 이런경우의 Western을 하기 위해서 이 단백질의 Ab에 biotinylation을 하고 strepavidin-HRP로 잡기로 하였습니다. > >biotinylation을 한 후 lysate로 일단 조건을 잡아서 streptavidin의 농도는 1/10000이상이면 매우 clear하게 나옴을 확인하였습니다. 그런데, IP product를 loading하면 이게 heavy or light chain인지 뭔지 모를 Non-specific이 몇개 진하게 나옵니다. streptavidin-HRP를 1/40000까지 낮추어도 나옵니다. streptavidin이 혹시 Ab를 잡나요?? 아니면 무슨 잡밴드일까요?? 왜 이렇게 Non-specific band가 보이는지 고수님들의 조언 부탁드립니다. 우선 IP를 할때는 biotinylated-Ab가 당근 아니겠죠? Non-specific은 여러가지 이유에 의해서 나오기 때문에 대조구를 이용하여 확인하셔야 할 것 같습니다. 단백질, 항체 (IP용) 각각을 대조구로 사용하여 웨스턴 후 어디에서 동일 밴드가 뜨는지를 확인할 필요가 있는 것 같네요(항원의 양이 많지 않다면 문제가 될수도 있겠지만 원하는 밴드보다는 non-specific band에 초점을 마추고..).. Blocking 조건도 잡을 겸 해서요.. 그리고 Pierce에서 항원만 떼어내는 reagent를 판매하고 있으니 사용해보시면 좋을 것 같습니다. 좋은 실험 되세요..