2007-06-21
org.kosen.entty.User@74169e29
오민아(ominali)
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제가 요즘 HEK293 cell에 원하는 유전자가 들어간 adenoviral vector를 transfection해서 adenovirus를 만들고 있습니다.
그런데 vector size도 너무 크고 (insrt+vector=~36kb)
Pac I 처리 후에 ppt 과정에서 DNA loss도 많이 생깁니다.
이상하게 maxi prep을 해도 DNA가 잘 안뽑히고,
transfection을 하려면 1ug/ul DNA가 좋은데 이렇게 잘 나오지를 않습니다.
그리고 일단 transfection을 해서 HEK293 cell을 harvest했는데
이 과정이 프로토콜마다 너무 달라서 이 과정도 궁금합니다.
저희 실험실에서 처음 adenovirus를 만들고 있어서
아직도 이렇게 헤메고 있답니다.
PacI 처리 후 ppt 과정 후에도 DNA농도를 어떻게 높게 유지할 수 있을까요?
adenovirus를 직접 제작해 보신 분들의 도움이 절실히 필요합니다.ㅠㅠ
참고로 전 invitrogen에서 나온 pDEST/V5/Ad vector를 사용하고 있습니다.
- adenovirus
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답변 1
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답변
한재석님의 답변
2007-06-26- 0
첫번째, PacI처리후 침전을 시키지 않고 바로 transfection을 해도 됩니다. 두번째, 어느 회사의 vector를 사용하시는 지 모르지만, 보통 아데노바이러스 벡터는 low copy 플라스미드인 경우가 많습니다. 저의 경우는 500ml 배양후에 겨우 100ug정도 얻은 경우도 있습니다. Qiagene의 경우 low copy or ultra low copy 플라스미드를 얻는 protocol이 따로 있습니다. 그 방법을 이용하시면 좀더 많은 plasmid를 얻을 수 있으리라 생각됩니다. 세번째, transfection후에 약 1-2주후에야 plaque가 생긴 것을 확인 할 수 있습니다. 100mm dish에서 transfection을 했을 때 저의 경우는 10개 이하의 plaque이 생겼습니다. 그리고 어느 protocol을 따라 하셔도 크게 다르지 않으니 그냥 하나를 결정해서 그대로 따라하시면 될 듯 싶습니다. 도움이 되었길 바라며, 더 필요한 정보가 있으면 연락 주십시요. >제가 요즘 HEK293 cell에 원하는 유전자가 들어간 adenoviral vector를 transfection해서 adenovirus를 만들고 있습니다. > >그런데 vector size도 너무 크고 (insrt+vector=~36kb) >Pac I 처리 후에 ppt 과정에서 DNA loss도 많이 생깁니다. > >이상하게 maxi prep을 해도 DNA가 잘 안뽑히고, >transfection을 하려면 1ug/ul DNA가 좋은데 이렇게 잘 나오지를 않습니다. > > >그리고 일단 transfection을 해서 HEK293 cell을 harvest했는데 >이 과정이 프로토콜마다 너무 달라서 이 과정도 궁금합니다. > > >저희 실험실에서 처음 adenovirus를 만들고 있어서 >아직도 이렇게 헤메고 있답니다. > >PacI 처리 후 ppt 과정 후에도 DNA농도를 어떻게 높게 유지할 수 있을까요? > >adenovirus를 직접 제작해 보신 분들의 도움이 절실히 필요합니다.ㅠㅠ > > > >참고로 전 invitrogen에서 나온 pDEST/V5/Ad vector를 사용하고 있습니다.