2007-07-01
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김지태(jitae115)
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미생물로부터 효소 억제제를 분리하는 학생입니다.
거의 분리가 다 되었다고 여겨 IC50을 구하기 위해
억제제 농도별 효소 활성도를 측정하였습니다.
활성은 흡광도를 이용하여 측정하는데요,
문제는 억제제를 넣지않은 대조군이 흡광도 1 이라고 했을 때
억제제를 아무리 넣어도 25%(흡광도 0.25) 정도는 반응한 것으로 측정되었습니다.
반응시 들어가는 보든 시료에 대해 대조군을 설정하였으나 특별히 영향을 미치는 것을 발견하지 못했구요,
기계적으로 그정도 수치가 항상 나타나는가 싶어 효소 농도를 두배로 증가시킨 후에 재실험을 했습니다만, (대조군흡광도 2) 이번에는 0.7 정도의 흡광도에서 거의 평형이 이루어집니다.
즉 아무리 억제제를 때려 넣어도 100% 효소를 억제할 수 없다는 건데요,
일반적으로 가능한 경우일까요?? 아니면 분리를 다 못시킨 것일까요??
고수님들의 답변 기다립니다....ㅠㅠ
- enzyme
- inhibitor
- concentration
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 6
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답변
배우철님의 답변
2007-07-02- 0
적어 놓으신 것을 보면 실험적으로 흠 잡을 요소는 없이 아주 잘 하신것 같습니다.. 정제가 덜 되었다고 해도 억제제의 농도를 높여주면 활성이 많이 나타나야 하고.. 기질의 제한 때문에 더 넣어주시는 것도 확인을 했구요... 실험을 잘 하셨기 때문에 그렇지 않을 것이라고 생각합니다만.. 혹시 활성도 측정시에 발색 등을 위하여 추가적인 시약이 첨가되지 않나요? 아니면 혹시 보조 인자 같은 것이 필요한지도 모르겠군요.. >미생물로부터 효소 억제제를 분리하는 학생입니다. > >거의 분리가 다 되었다고 여겨 IC50을 구하기 위해 > >억제제 농도별 효소 활성도를 측정하였습니다. > >활성은 흡광도를 이용하여 측정하는데요, > >문제는 억제제를 넣지않은 대조군이 흡광도 1 이라고 했을 때 > >억제제를 아무리 넣어도 25%(흡광도 0.25) 정도는 반응한 것으로 측정되었습니다. > >반응시 들어가는 보든 시료에 대해 대조군을 설정하였으나 특별히 영향을 미치는 것을 발견하지 못했구요, > >기계적으로 그정도 수치가 항상 나타나는가 싶어 효소 농도를 두배로 증가시킨 후에 재실험을 했습니다만, (대조군흡광도 2) 이번에는 0.7 정도의 흡광도에서 거의 평형이 이루어집니다. > >즉 아무리 억제제를 때려 넣어도 100% 효소를 억제할 수 없다는 건데요, > >일반적으로 가능한 경우일까요?? 아니면 분리를 다 못시킨 것일까요?? > > >고수님들의 답변 기다립니다....ㅠㅠ -
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김중재님의 답변
2007-07-03- 0
뭐.. 고수는 아니지만... 실험 방법에 문제가 있는지, 원래 그 정도 밖에 되지 않는건지.. 이미 잘 알려진 억제제로 테스트를 해 보시면 알 수 있지 않을까 싶네요. -
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김지태님의 답변
2007-07-03- 0
일단 분리한 억제 물질은 용해도가 매우 낮습니다. 가장 잘 녹는 메탄올에서도 1mg/ml 정도만 녹으며, 그 외 다른 용매에는 안녹거나 매우 적은 양이 녹는다고 보시면 됩니다. 반면에 염기성 용액에서 용해도가 좋아집니다. 염기성 물보다도 염기를 첨가한 메탄올에 훨씬 더 잘 녹습니다. 반응시에는 효소가 0.4unit/ml, 기질이 0.73mM, 버퍼는 25mM phosphate buffer (pH6.8), 효소와 기질은 버퍼에 녹인것을 사용하구요. 반응온도는 37도, 반응시간은 20분입니다. 이때 IC50이 0.7 ㎍/ml 이구요. 반응 종료는 암모니아수를 반응시 부피의 두배를 넣어 종료시킵니다. 그리고 이것을 microplate reader를 이용해 측정을 하지요. (이조건은 이미 셋팅되어있던것을 사용하는 겁니다.) 그리고 다른 기준시약(억제제)로 활성을 측정해보라 하셨는데, 이 미생물이 만드는 다른 억제물질같은 경우에는 양에 따라 90% 이상 억제하는 경우도 있기에 모든 경우가 이렇게 될 수는 없을것으로 생각되네요. (그리고 그 억제제 값이 너무 나가서요...ㅠㅠ 한번 해보는것도 겁나요ㅋ) 이렇게 적어놓고 보니 버퍼 농도가 더 큰게 눈에 띠네요... 버퍼가 문제를 만들수도 있을까요?? 하여간 질문에 관심가져주셔서 너무 감사할 따름입니다 ㅜㅜ 나중에 왜 그런지에 대해 제가 찾게되면 그 내용을 꼭 올리것습니다. -
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김남철님의 답변
2007-07-03- 0
어느 정도의 농도를 사용하셨으며 그 분리된 물질의 용해도나 그 외 기타 물성은 어떤지요? -
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김지태님의 답변
2007-07-04- 0
몰농도는 아직 이 물질 구조를 분석하지 않아서 분자량을 모른답니다.... 일단 이상태로 lineweaver - burk plot을 통해 어떤 억제 타입인지를 확인해 보아야 할 것 같네요.. 답변 너무 감사드립니다. ^^ -
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김남철님의 답변
2007-07-04- 0
용해도를 물어본 이유는 용해도가 낮은 경우 고농도로 처리할 때 결정으로 떨어지는 경우를 간혹 보았기 때문입니다. 저는 주로 몰농도를 써서 그람단위를 쓰시니 별로 감이 오질 않는군요.. 그리고 어떤 효소인지 모르겠지만 여러가지 이유가 존재할 수 있습니다. 비특이적, 비경쟁적 저해제일 수도 있고요.. 저해제가 효소에 의해서 깨질 수도 있고 여러가지 상상 가능한 경우가 있습니다. 말씀대로 덜 정제되서 뭔가가 섞여 있을지도 모르지요.. 이유를 찾으시기를...