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>안녕하세요 >JC-1을 이용해서 MPT를 측정하려고 합니다 >지금 이용하고 있는 세포는 rat primary hepatocyte인데 >JC-1 분석시에 dot plot이 둥글게 분포되는게 아니라 >선형으로 분포됩니다 >uncoupling sample에서는 FL-2 shift가 일어나지 않고 >FL-1, FL-2 shift가 동시에 일어나며 왼쪽아래로 >전체 분포가 이동합니다 >(그림 첨부하였습니다) > >PMT나 compensation을 아무리 조절해보아도 >분포가 제대로 나오질 않네요 >논문에서처럼 깔끔한 그림을 만들어야되는데 말이죠.. >L6 cell에서도 해보았는데 역시 똑같았습니다 > >사용중인 dye는 molecular probe제품이고 >기기는 FACs calibur 입니다 > >조언 부탁드립니다 >아니면 혹시 JC-1 data 잘나오신분 있으면 >연락처 좀 남겨주세요 >직접 연락하거나 직접 찾아뵙게 배우고 싶습니다..ㅠㅠ 일단 본인이 예전에 발표했던 논문에서 사용되었던 실험 방법을 적어드리면, Measurement of mitochondrial membrane potential (Δψm). Cells at PD30 were incubated in the medium containing 20 mM nicotinamide only or together with 20 μM rotenone or 8 μg mL−1 oligomycin for 24 h before being assayed. To determine the effect of nicotinamide on Δψm, 0.3 μg mL−1 JC-1 (5,5′,6,6′- tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidalohylcarbocyanine iodide; Invitrogen) was added to cells. After 30 min at 37 °C, cells were washed with PBS, trypsinized and collected in 1 mL PBS, and applied to FACS. The fluorescence at 585 nm (FL2) and 525 nm (FL1) was measured for the JC-1-treated cells as well as the mock-treated cells. To correct for autofluorescence, the FL2 and FL1 values from the JC-1-treated cells were subtracted with those from the mock treated cells. Δψm was determined by dividing the corrected FL2 value by the corrected FL1 value. -- Aging Cell, vol.5, pp423-436 (2006) 위의 방법대로 해보세요. 경험에 의하면, JC-1의 농도를 너무 높게 사용한다거나 staining time을 너무 길게 할 경우에는 JC-1의 mitochondrial accumulation이 증가되어서 이것들이 aggregates를 형성해서 red signal이 너무 강하게 나오는 일이 발생됩니다. FACS로 분석할 경우엔 별 문제가 되질 않지만, 형광현미경으로 관찰할 경우에는 각각의 channel을 분리해서 볼 경우엔 괜챦지만, green과 red의 overlay를 관찰할 경우엔 거의 모든 세포가 red로만 보이는 문제가 있습니다. 그리고, uncoupling시에는 green과 red의 신호가 모두 변합니다. uncoupling에 의해서 JC-1이 mitochondria에 축적이 되질 않아서, red 신호가 약해지고, 축적이 되지않은 JC-1 monomer들은 cytosol로 나가서 green 신호를 증가시키기 때문입니다. 첨부 화일로 하나는 JC-1을 이용한 mitochondrial membrane potential 측정에 관련된 자료이고, 하나는 uncoupler가 처리된 세포에서 JC-1의 신호가 어떻게 변하는지를 본인이 측정한 자료입니다. 참고를 하시고 그 밖의 의문사항들은 다시 질문을 하세요...

친절한 조언에 감사드립니다 조언해주신 방법과 논문을 토대로 다시 실험을 해보겠습니다 다시 한번 감사드립니다^^