2007-07-11
org.kosen.entty.User@5f89acd
김지혜(bluebada)
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mouse 장기를 적출하여 최종적으로 RT-PCR를 하려고 합니다
kidney, liver 는 전혀 문제 없이 RNA isolation 이 잘 되는데요...
spleen은 벌써 두번째 실패했어요
RNA가 degradation 됩니다.
Qiagen에서 나온 RNeasy Mini kit를 사용하였는데 잘 안됩니다..
Mannual로 해봐야하는 건지
spleen에서 RNA 뽑는 게 어렵다고들 하는데,
어떤 과정을 특히 조심해야하는지 팁을 좀 주세요...
조직은 10 mg 양으로 하고, 정량시 농도나 ratio는 잘 나옵니다.
- spleen
- RNA
- mouse
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답변 2
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답변
한재석님의 답변
2007-07-12- 0
RNA isolation에서 가장 중요한 스텝은 적출한 장기를 얼마나 신속하게 처리하느냐에 달려있다고 할 수 있습니다. 보통 적출하자마자 liquid nitrogen에 얼려버리는 방법을 많이 쓰시죠. 아니면 아주 fresh하게 적출하자마자 trizol이나 kit의 경우 lysis buffer에서 바로 homogenization합니다. 제 경우는 Ambion에서 나온 RNAlater라는 용액에 적출된 장기를 바로 넣어 4도에 하룻밤 보관후 나중에 씁니다. 사용하기도 편하고 또 결과도 잘 나와서 제가 애용하는 방법이지요. Spleen의 경우도 이렇게 해서 별 어려움 없이 RNA를 뽑았습니다. 도움이 되셨길 바랍니다. >mouse 장기를 적출하여 최종적으로 RT-PCR를 하려고 합니다 > >kidney, liver 는 전혀 문제 없이 RNA isolation 이 잘 되는데요... > >spleen은 벌써 두번째 실패했어요 > >RNA가 degradation 됩니다. > >Qiagen에서 나온 RNeasy Mini kit를 사용하였는데 잘 안됩니다.. > >Mannual로 해봐야하는 건지 > >spleen에서 RNA 뽑는 게 어렵다고들 하는데, > >어떤 과정을 특히 조심해야하는지 팁을 좀 주세요... > >조직은 10 mg 양으로 하고, 정량시 농도나 ratio는 잘 나옵니다. > > -
답변
김상우님의 답변
2007-07-14- 0
저의 경우에는 마찬가지로 Qiagen에서 나온 RNeasy Mini kit을 사용하여 RNA isolation을 실시하였습니다. 조직을 10mg을 사용하셨다고 하셨는데 동결된 상태일 경우 액체질소에소 분쇄후 약 5mg정도를 lysis시키게 되시면 쉽게 얻으실 수 있으실겁니다. 조직이 녹게 되면 거의 대부분 RNA가 degradation됩니다. pancreas와 spleen의 경우 RNA degradation이 빨리 이루어지기 때문에 장기 적출 후에도 신속히 액체질소에 보관하거나 deep freezer에 보관합니다. lysis시키는 단계에서 저온으로 유지하면서 빨리 lysis시키는것이 중요합니다. 그리고 조직의 양이 많게 되면 그만큼 RNase가 많기 때문에 degradation 또한 빨리 이루어집니다. 적은 양의 조직을 사용하고 저온으로 신속히 lysis시키는것이 팁입니다. 수고하세요 >mouse 장기를 적출하여 최종적으로 RT-PCR를 하려고 합니다 > >kidney, liver 는 전혀 문제 없이 RNA isolation 이 잘 되는데요... > >spleen은 벌써 두번째 실패했어요 > >RNA가 degradation 됩니다. > >Qiagen에서 나온 RNeasy Mini kit를 사용하였는데 잘 안됩니다.. > >Mannual로 해봐야하는 건지 > >spleen에서 RNA 뽑는 게 어렵다고들 하는데, > >어떤 과정을 특히 조심해야하는지 팁을 좀 주세요... > >조직은 10 mg 양으로 하고, 정량시 농도나 ratio는 잘 나옵니다. > >