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지식나눔

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PCR이 안되요~

2007-07-18 org.kosen.entty.User@56fab34c 이현정(endeavor821)
  • 2
안녕하세요. 실험하다 문제가 발생해서 해결책을 찾고자 이렇게 글 남깁니다. 다름이 아니라 PCR이 잘 안되서요.. 실험실에 있던 primer로 PCR를 여러번 해봤지만 잘 안되서 논문을 참고해 Primer를 새로 주문해서 했는데도 PCR이 안되요. Annealing 온도와 cycle 수, 그리고 PCR kit까지 바꿔가며 했는데도 안 되네요. 온도는 52, 53, 55, 56, 58, 60 으로 다 해봤는데도 100bp 정도의 위치에서 dimer로 보이는 밴드만 관찰되고 정작 제가 보고자 하는 위치에는 밴드가 안떠요. PCR kit에서 PCR이 잘 안될때 사용하는 buffer를 첨가해서 했는데도 불구하고 안되네요.. 이유가 뭘까요?? 어떻게 하면 될지 해결책 부탁드립니다. 그럼 빠른 답변 기다리겠습니다. 즐건 하루 되세요~
  • PCR
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답변 2
  • 답변

    서기원님의 답변

    2007-07-18
    • 0
    초심자는 이니신것 같지만 그래도 제 경험상 실험이라는게 원래 확인해볼거 거의 다 해봤는데도 안되면 가끔 착각하여 실험자 본인이 심각한 잘못을 하고 있거나 확실하다고 믿는 것에서 잘못된 경우가 많거든요... 우선 꼼꼼히 다시한번 체크해보세요... primer 다시만드셨고 컨디션 실험도 하였으면 할거 왠만큼 하셨네요.. 이런경우, RNA에서 cDNA 만들어 하시는지 DNA로 하시는지는 잘 모르겠지만 우선 control PCR 해보세요.. 혹시 이미 해보셨나? 하우스 킵핑 유전자들 있져? 논문에도 control로 자주 등장하는... 아무거나 함 해보셔서 잘 되면, 우선 실험자 본인과 Taq, buffer, 조건등 PCR material과 method엔 문제가 없음이 증명된 샘이고 그러면, 대부분 몇가지 이유임다. 1. primer 잘못 제작 : 다시 만들었다고는 하셨지만 원리를 잘 모르시거나 착각하셔서 forward나 reverse 잘못 제작하는 경우 흔하게 일어납니다. 잘 아시는 분과 꼼꼼히 확인해보세요.. 2.Tamplate가 잘못되었거나 내가 원하는 유전자가 아닌 경우 : template DNA 다시 확보 및 확인. 특히 다른사람이 했거나, 실험실에 있었던 경우는 더욱이(예로, 만약 이미 cloning되어 있는 유전자를 필요에 의해 다시 cloning하는 경우가 있는데 이런경우 특히 의심해보아야 함. template DNA sequencing을 통해 확인)
    답변수정
    초심자는 이니신것 같지만 그래도 제 경험상 실험이라는게 원래 확인해볼거 거의 다 해봤는데도 안되면 가끔 착각하여 실험자 본인이 심각한 잘못을 하고 있거나 확실하다고 믿는 것에서 잘못된 경우가 많거든요... 우선 꼼꼼히 다시한번 체크해보세요... primer 다시만드셨고 컨디션 실험도 하였으면 할거 왠만큼 하셨네요.. 이런경우, RNA에서 cDNA 만들어 하시는지 DNA로 하시는지는 잘 모르겠지만 우선 control PCR 해보세요.. 혹시 이미 해보셨나? 하우스 킵핑 유전자들 있져? 논문에도 control로 자주 등장하는... 아무거나 함 해보셔서 잘 되면, 우선 실험자 본인과 Taq, buffer, 조건등 PCR material과 method엔 문제가 없음이 증명된 샘이고 그러면, 대부분 몇가지 이유임다. 1. primer 잘못 제작 : 다시 만들었다고는 하셨지만 원리를 잘 모르시거나 착각하셔서 forward나 reverse 잘못 제작하는 경우 흔하게 일어납니다. 잘 아시는 분과 꼼꼼히 확인해보세요.. 2.Tamplate가 잘못되었거나 내가 원하는 유전자가 아닌 경우 : template DNA 다시 확보 및 확인. 특히 다른사람이 했거나, 실험실에 있었던 경우는 더욱이(예로, 만약 이미 cloning되어 있는 유전자를 필요에 의해 다시 cloning하는 경우가 있는데 이런경우 특히 의심해보아야 함. template DNA sequencing을 통해 확인)
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  • 답변

    허광래님의 답변

    2007-07-19
    • 0
    PCR... 이거 잘되면 본전이고 안되면 정말 황당하지요. 일단 어떤 종류의 PCR인지 상술해 주세요. 1) template source: 염색체 (고등 동물? 식물? 미생물?), 플라스미드 2) template prep: chromosomal? colony? PCR 3) PCR 종류: normal? inverse? nested? block? ....... 4) expected PCR size 이걸 알아야지 무슨 이야기를 해 드리지요... 다음은 기본 질문입니다. 1) 기계는 바꾸어 보셨는지? 2) + control은 사용하셨는지? 3) template와 primer는 다 agroge gel로 확인하셨는지요? 이상에 대한 설명을 주시면 같이 고민을 다시 해 보시지요.. 참고로 제가 있는 방은 PCR을 허구한날 하는 방입니다. 대전에서 >안녕하세요. > >실험하다 문제가 발생해서 해결책을 찾고자 이렇게 글 남깁니다. > >다름이 아니라 PCR이 잘 안되서요.. > >실험실에 있던 primer로 PCR를 여러번 해봤지만 잘 안되서 논문을 참고해 Primer를 새로 > >주문해서 했는데도 PCR이 안되요. > >Annealing 온도와 cycle 수, 그리고 PCR kit까지 바꿔가며 했는데도 안 되네요. > >온도는 52, 53, 55, 56, 58, 60 으로 다 해봤는데도 100bp 정도의 위치에서 dimer로 보이는 > >밴드만 관찰되고 정작 제가 보고자 하는 위치에는 밴드가 안떠요. > >PCR kit에서 PCR이 잘 안될때 사용하는 buffer를 첨가해서 했는데도 불구하고 안되네요.. > >이유가 뭘까요?? 어떻게 하면 될지 해결책 부탁드립니다. > >그럼 빠른 답변 기다리겠습니다. > >즐건 하루 되세요~
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    PCR... 이거 잘되면 본전이고 안되면 정말 황당하지요. 일단 어떤 종류의 PCR인지 상술해 주세요. 1) template source: 염색체 (고등 동물? 식물? 미생물?), 플라스미드 2) template prep: chromosomal? colony? PCR 3) PCR 종류: normal? inverse? nested? block? ....... 4) expected PCR size 이걸 알아야지 무슨 이야기를 해 드리지요... 다음은 기본 질문입니다. 1) 기계는 바꾸어 보셨는지? 2) + control은 사용하셨는지? 3) template와 primer는 다 agroge gel로 확인하셨는지요? 이상에 대한 설명을 주시면 같이 고민을 다시 해 보시지요.. 참고로 제가 있는 방은 PCR을 허구한날 하는 방입니다. 대전에서 >안녕하세요. > >실험하다 문제가 발생해서 해결책을 찾고자 이렇게 글 남깁니다. > >다름이 아니라 PCR이 잘 안되서요.. > >실험실에 있던 primer로 PCR를 여러번 해봤지만 잘 안되서 논문을 참고해 Primer를 새로 > >주문해서 했는데도 PCR이 안되요. > >Annealing 온도와 cycle 수, 그리고 PCR kit까지 바꿔가며 했는데도 안 되네요. > >온도는 52, 53, 55, 56, 58, 60 으로 다 해봤는데도 100bp 정도의 위치에서 dimer로 보이는 > >밴드만 관찰되고 정작 제가 보고자 하는 위치에는 밴드가 안떠요. > >PCR kit에서 PCR이 잘 안될때 사용하는 buffer를 첨가해서 했는데도 불구하고 안되네요.. > >이유가 뭘까요?? 어떻게 하면 될지 해결책 부탁드립니다. > >그럼 빠른 답변 기다리겠습니다. > >즐건 하루 되세요~
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