2007-07-26
org.kosen.entty.User@5bcbec8c
손숙진(sookzim)
- 1
저는 PCR 을 많이하지 않아본 초보입니다.
그래도 가르쳐준 사람이 이미 셋팅이 되어있고 잘 되던데로
계속 하고있는데 처음엔 잘나왔다가 점점 틀어지는거 같아요
우선 제가 하는 실험 개요에 대해서 말씀 드리면
single cell RT(reverse transcrition) PCR입니다.
cell은 살아있는 rat의 brain조직에서 원하는 부위의 neuron을 빨아들여서 쓰고. 그래서 RT 후에 제한된 양 20ul로 5가지를 PCR합니다.
그래서 중간단계에서 전체 RNA양이며 검증할 처지가 못되고 모든 양을 다 쓰고있어요.
PCR과정이 끝난후에 젤 로딩후 확인하면...
잡밴드들이 상당히 많습니다. 물론 처음 했을때는 원하던 타겟만 나왔었죠. 점점 잡밴드가 나오다가 또 안나오기도 하다가 이제는 완전 상습적으로 나오네요.
처음에는 어느정도 통일되게 같은 사이즈(원하던 사이즈는 아니고) 에서 주로 뜨고 간혹 원하는 사이즈도 뜨기도 하고...
이제는 완전 지맘대로 마치 사이즈마커처럼 나오는것도 있고 그렇게 잡밴드가 뜨네요.
처음엔 물에 오염이 있는지 생각 했는데... 키트에 들어있는 물 새거를 써도 그렇고.
negative control 로 샘플 대신 물을 넣고 한거에서 어떤건 아예 깨끗하고 어떤건 잡밴드가 나오고 그러네요.
제가 어떻게 검증해봐야 될까요?
또 한가지 물만 넣고 RT-PCR을 한거에서 GAPDH 밴드가 뜨는건 또 무슨 일일까요. 두번했는데 두번다 GAPDH에만 밴드가 뜨네요.
마지막으로 DMSO도 오염이 되나요?
머리가 복잡합니다 ㅎㅎ
조언부탁드립니다. ^^
- PCR
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
허광래님의 답변
2007-07-27- 0
현상을 살펴 본 느낌은 아래와 같습니다. 1)물만 넣고 RT-PCR을 한거에서 GAPDH 밴드가?? --> 이런 황당한...물에 오염이 되어있거나, RT-PCR kit 혹은 파이펫 관련 부위 (특히 파이펫 맨의 플라스틱 끝 부분)에 오염이 확실합니다. ** 해결책 : 물은 사서 쓰고, 파이펫은 분해 소지하고 tip 중간에 오염방지층이 있는 것으로 사서 쓰고..(다 돈이지요?) 나머지 오염도 이것이 더욱 더 원천적이므로, 모두 가능함 2)DMSO오염 여부 --> 생명체가 자리지는 못하겠지만, PCR의 경우는 핵산만 있으면 가능하므로, 본 실험의 경우에는 충분한 오염원으로 작용 가능합니다. 누군가 세포가 왕창 묻은 파이펫으로 오염시켰을 가능성을 배재 못함 3) PCR에 사용하는 올리고 프라이머 검증 프라이머도 냉동고에 오래 놓아두면 간혹 분해가 됩니다. 실험이 잘 안되면 가끔씩은 >2% 아가로즈 젤을 걸어서 확인하면 좋습니다. 대전에서 >저는 PCR 을 많이하지 않아본 초보입니다. >그래도 가르쳐준 사람이 이미 셋팅이 되어있고 잘 되던데로 >계속 하고있는데 처음엔 잘나왔다가 점점 틀어지는거 같아요 > >우선 제가 하는 실험 개요에 대해서 말씀 드리면 >single cell RT(reverse transcrition) PCR입니다. >cell은 살아있는 rat의 brain조직에서 원하는 부위의 neuron을 빨아들여서 쓰고. 그래서 RT 후에 제한된 양 20ul로 5가지를 PCR합니다. >그래서 중간단계에서 전체 RNA양이며 검증할 처지가 못되고 모든 양을 다 쓰고있어요. >PCR과정이 끝난후에 젤 로딩후 확인하면... >잡밴드들이 상당히 많습니다. 물론 처음 했을때는 원하던 타겟만 나왔었죠. 점점 잡밴드가 나오다가 또 안나오기도 하다가 이제는 완전 상습적으로 나오네요. >처음에는 어느정도 통일되게 같은 사이즈(원하던 사이즈는 아니고) 에서 주로 뜨고 간혹 원하는 사이즈도 뜨기도 하고... >이제는 완전 지맘대로 마치 사이즈마커처럼 나오는것도 있고 그렇게 잡밴드가 뜨네요. >처음엔 물에 오염이 있는지 생각 했는데... 키트에 들어있는 물 새거를 써도 그렇고. >negative control 로 샘플 대신 물을 넣고 한거에서 어떤건 아예 깨끗하고 어떤건 잡밴드가 나오고 그러네요. >제가 어떻게 검증해봐야 될까요? > >또 한가지 물만 넣고 RT-PCR을 한거에서 GAPDH 밴드가 뜨는건 또 무슨 일일까요. 두번했는데 두번다 GAPDH에만 밴드가 뜨네요. > >마지막으로 DMSO도 오염이 되나요? > >머리가 복잡합니다 ㅎㅎ >조언부탁드립니다. ^^ >