2007-08-11
org.kosen.entty.User@1be6a29c
황희선(elmo1218)
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RINm5F cell에서 분비되는 insulin을 staining 해서 형광현미경으로 관측했는데
형광염색이 잘안되었는지 형광이 금방사라지고 희미하더라구요..
primary antibody 와 secondry antibody를 각각 2시간이 반응시켰구요
마지막 형광을 20분 반응시켰답니다..
어떻게 하면 형광현미경으로 잘 관측할수 있을까요?
고수님들 답변부탁드립니다..
- 형광현미경
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
서기원님의 답변
2007-08-13- 0
인슐린에 일차 항체가 잘 붙는지? 그리고 일차와 이차를 제대로 쓰셨는지?(예로 마우스 기원의 일차의 경우 안티 마우스 이차 사용) 등을 확실하게 확인 하셨는지요.. 보통 dot blot을 통해 간단히 확인합니다. 이것이 제대로 되셨다면 형광물질이 제대로 염색되지 않았단 얘기인데 형광을 반응시켰다는 말을 마지막에 형광물질을 붙였다는 말인가요? 이렇게 이해하고 말씀드리면, 이차 항체에만 특이적으로 형광물질을 붙이기 위해 어떤식으로 형광물질을 염색하나요?.. 모든 실험 처리후, 이차 항체만 형광물질로 염색하려면 또다른 방법들을 써야만 될것 같은데,,,, 위에 써놓으신데로 이해해보면 조금은 실험을 잘못하신게 아닌가 싶은데요. 그리고 이차에 형광물질을 붙일꺼면 그냥 직접 일차에 붙이지 그래요..? 왜 굳이 이차에 형광물질을 붙이나요..? 그럼 백그라운도 없애는 블록킹과정을 안해도 되는데.. 제가 아직 학생이라 지식이 짧아 그런지는 모르겠으나 일반적으로 쓰지 않는 방법인것 같습니다.. 일차를 이용하여 직접 형광발색을 원하는 경우가 아니라면, 보통은 형광물질이 붙어있는 이차항체를 파는데 그걸 사용하거든요.. 실험자가 직접 붙여쓰는 경우도 종종 있지만 여러 과정을 거쳐야 되는데, 형광물질이 붙은 이차항체는 쉽게 구입가능하고 가격도 그리 비싼 편이 아니라서.. 그리고 저도 해본적은 없지만 아마도 실험 마지막 과정에 형광물질을 붙이지 않고 이차항체와 형광물질을 먼저 반응시키고 형광물질이 붙은 항체만을 분리한후 실험에 사용 해야 할것 같은데요.. 실험 상황을 잘 몰라서.. 도움이 되셨으면 합니다....