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지식나눔

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western blotting시 detection하니 background가 심해서요..질문이요..

2007-08-23 org.kosen.entty.User@43c7bcba 황혜정(dianastar)
  • 4
제가 western을 하는데요... blocking buffer로 5%BSA써서 했는데..background가 심하게 나와서 washing을 O/N해서 다시 detection하니까..그나마 좀 나아지긴 했는데 band가 정확히 보이지 않아서 조건을 바꿔서 3% skim milk를 사용해서 실험했습니다. 똑같이 O/N washing하구요 detection했는데.. 더 지져분하게 나와서요... 어떻게 조건을 바꿔야 할지 모르겠어요.. 3% skim milk보다는 5% BSA가 차라리 band 형태가 나타나거든요 어떻게 하면 깨끗하게 band를 확인 할 수 있을까요?
  • western blotting
  • background
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답변 4
  • 답변

    김은민님의 답변

    2007-08-23
    • 0
    다른 문제가 아닐까 생각은 해보셨나요? 세컨더리 안티바디는 얼마나 반응하셨나요? bacgroun가 많이 뜨는 이유는 여러가지 이유가 있답니다. 다시한번 고민해보세요~ 너무 많은 양, 혹은 너무 오랜시간동안 안티바디 반응을 하신건 아니신지.. >제가 western을 하는데요... >blocking buffer로 5%BSA써서 했는데..background가 심하게 나와서 >washing을 O/N해서 다시 detection하니까..그나마 좀 나아지긴 했는데 band가 정확히 보이지 않아서 > >조건을 바꿔서 3% skim milk를 사용해서 실험했습니다. >똑같이 O/N washing하구요 detection했는데.. >더 지져분하게 나와서요... > >어떻게 조건을 바꿔야 할지 모르겠어요.. >3% skim milk보다는 5% BSA가 차라리 band 형태가 나타나거든요 >어떻게 하면 깨끗하게 band를 확인 할 수 있을까요?
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    다른 문제가 아닐까 생각은 해보셨나요? 세컨더리 안티바디는 얼마나 반응하셨나요? bacgroun가 많이 뜨는 이유는 여러가지 이유가 있답니다. 다시한번 고민해보세요~ 너무 많은 양, 혹은 너무 오랜시간동안 안티바디 반응을 하신건 아니신지.. >제가 western을 하는데요... >blocking buffer로 5%BSA써서 했는데..background가 심하게 나와서 >washing을 O/N해서 다시 detection하니까..그나마 좀 나아지긴 했는데 band가 정확히 보이지 않아서 > >조건을 바꿔서 3% skim milk를 사용해서 실험했습니다. >똑같이 O/N washing하구요 detection했는데.. >더 지져분하게 나와서요... > >어떻게 조건을 바꿔야 할지 모르겠어요.. >3% skim milk보다는 5% BSA가 차라리 band 형태가 나타나거든요 >어떻게 하면 깨끗하게 band를 확인 할 수 있을까요?
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    손숙진님의 답변

    2007-08-24
    • 0
    여러가지 가능 요인이 있을걸로 생각 합니다. 님 말대로 blocking이 부족 하던지. primary antibody의 농도가 낮던가. 위엣분 말처럼 secondary antibody 가 과하게 처리 되었다던지... 원래 양이 적은 단백질을 억지로 보기 위해서 exposure 시간을 오래하게되어서 상대적으로 배경이 어둡고 지저분 하게 나오는 것인지... (필름 현상의 경우) antibody 붙이는 과정에서 어느정도 조건을 바꿔야 될 듯 합니다. 단백질에 따라서 skim milk를 사용하느냐 BSA를 사용하느냐 달라질 수 있습니다. 왜그런진 잘 모르겠지만 일반적으로 skim milk를 사용했었고 간간히 BSA를 사용했었던것 같거든요 ;;; BSA로 blocking한 건 primary 역시 BSA와 같이 해야된다는 사실도 아시죠? 좋은 답변이 되어드리지 못해서 죄송하구요 +_+;; 좋은 결과 있길 바랍니다. >제가 western을 하는데요... >blocking buffer로 5%BSA써서 했는데..background가 심하게 나와서 >washing을 O/N해서 다시 detection하니까..그나마 좀 나아지긴 했는데 band가 정확히 보이지 않아서 > >조건을 바꿔서 3% skim milk를 사용해서 실험했습니다. >똑같이 O/N washing하구요 detection했는데.. >더 지져분하게 나와서요... > >어떻게 조건을 바꿔야 할지 모르겠어요.. >3% skim milk보다는 5% BSA가 차라리 band 형태가 나타나거든요 >어떻게 하면 깨끗하게 band를 확인 할 수 있을까요?
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    여러가지 가능 요인이 있을걸로 생각 합니다. 님 말대로 blocking이 부족 하던지. primary antibody의 농도가 낮던가. 위엣분 말처럼 secondary antibody 가 과하게 처리 되었다던지... 원래 양이 적은 단백질을 억지로 보기 위해서 exposure 시간을 오래하게되어서 상대적으로 배경이 어둡고 지저분 하게 나오는 것인지... (필름 현상의 경우) antibody 붙이는 과정에서 어느정도 조건을 바꿔야 될 듯 합니다. 단백질에 따라서 skim milk를 사용하느냐 BSA를 사용하느냐 달라질 수 있습니다. 왜그런진 잘 모르겠지만 일반적으로 skim milk를 사용했었고 간간히 BSA를 사용했었던것 같거든요 ;;; BSA로 blocking한 건 primary 역시 BSA와 같이 해야된다는 사실도 아시죠? 좋은 답변이 되어드리지 못해서 죄송하구요 +_+;; 좋은 결과 있길 바랍니다. >제가 western을 하는데요... >blocking buffer로 5%BSA써서 했는데..background가 심하게 나와서 >washing을 O/N해서 다시 detection하니까..그나마 좀 나아지긴 했는데 band가 정확히 보이지 않아서 > >조건을 바꿔서 3% skim milk를 사용해서 실험했습니다. >똑같이 O/N washing하구요 detection했는데.. >더 지져분하게 나와서요... > >어떻게 조건을 바꿔야 할지 모르겠어요.. >3% skim milk보다는 5% BSA가 차라리 band 형태가 나타나거든요 >어떻게 하면 깨끗하게 band를 확인 할 수 있을까요?
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    서기원님의 답변

    2007-08-24
    • 0
    background가 심하게 뜨는 경우 1. wash 시간이 짧다. 일차와 이차 붙인후가 제일 중요 해결- 시간을 늘이거나 tween 20같은 계면활성제 넣어 사용 2. 일차 혹은 이차 농도를 너무 높게 사용한다.. 해결- 당연한 말이지만 사용 농도 다시 확인 하시고 적정농도 사용하세여.. 3. 블로킹이 잘 안되는 같다.. 일반적으로는 1% 이상 사용시 별 문제가 되지 않지만 다른 문제는 따히 없는 경우 해결- 블로킹 이후의 일차와 이차 붙이는 과정에 블로킹 버퍼 사용 (강추) 이것저것 할것 없이 3번 해결법만의 사용으로 일반적으로 백그라운드 절대 뜨지 않습니다.. 4. 만약, 일차가 polyclonal일 경우 항체 제조 과정에서 항원의 순도나 면역 유도 정도에 따라서 결합능력에 크게 영향을 줌..
    답변수정
    background가 심하게 뜨는 경우 1. wash 시간이 짧다. 일차와 이차 붙인후가 제일 중요 해결- 시간을 늘이거나 tween 20같은 계면활성제 넣어 사용 2. 일차 혹은 이차 농도를 너무 높게 사용한다.. 해결- 당연한 말이지만 사용 농도 다시 확인 하시고 적정농도 사용하세여.. 3. 블로킹이 잘 안되는 같다.. 일반적으로는 1% 이상 사용시 별 문제가 되지 않지만 다른 문제는 따히 없는 경우 해결- 블로킹 이후의 일차와 이차 붙이는 과정에 블로킹 버퍼 사용 (강추) 이것저것 할것 없이 3번 해결법만의 사용으로 일반적으로 백그라운드 절대 뜨지 않습니다.. 4. 만약, 일차가 polyclonal일 경우 항체 제조 과정에서 항원의 순도나 면역 유도 정도에 따라서 결합능력에 크게 영향을 줌..
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    박은혜님의 답변

    2007-12-20
    • 0
    Skin milk 에는 다양한 protein 이 담겨 있습니다. 그에 비해서 BSA 는 그 종이 다양하지 못합니다. 그렇기 때문에 님의 샘플과 skin milk 의 protein 이 cross-reactivity 가 될 수도 있어 background 가 더욱 더 지저분한 것입니다. >제가 western을 하는데요... >blocking buffer로 5%BSA써서 했는데..background가 심하게 나와서 >washing을 O/N해서 다시 detection하니까..그나마 좀 나아지긴 했는데 band가 정확히 보이지 않아서 > >조건을 바꿔서 3% skim milk를 사용해서 실험했습니다. >똑같이 O/N washing하구요 detection했는데.. >더 지져분하게 나와서요... > >어떻게 조건을 바꿔야 할지 모르겠어요.. >3% skim milk보다는 5% BSA가 차라리 band 형태가 나타나거든요 >어떻게 하면 깨끗하게 band를 확인 할 수 있을까요?
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    Skin milk 에는 다양한 protein 이 담겨 있습니다. 그에 비해서 BSA 는 그 종이 다양하지 못합니다. 그렇기 때문에 님의 샘플과 skin milk 의 protein 이 cross-reactivity 가 될 수도 있어 background 가 더욱 더 지저분한 것입니다. >제가 western을 하는데요... >blocking buffer로 5%BSA써서 했는데..background가 심하게 나와서 >washing을 O/N해서 다시 detection하니까..그나마 좀 나아지긴 했는데 band가 정확히 보이지 않아서 > >조건을 바꿔서 3% skim milk를 사용해서 실험했습니다. >똑같이 O/N washing하구요 detection했는데.. >더 지져분하게 나와서요... > >어떻게 조건을 바꿔야 할지 모르겠어요.. >3% skim milk보다는 5% BSA가 차라리 band 형태가 나타나거든요 >어떻게 하면 깨끗하게 band를 확인 할 수 있을까요?
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