2007-08-31
org.kosen.entty.User@1f84c399
선종흠(humi09)
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제가 이실험을 하려고 검색을 해서 프로토콜을 구했는데..
몇 가지 궁금 한게 있어서 질문 합니다.
주변분들의 대답이 모두 다 달라서 헷갈립니다. -_-
우선 실험 프로토콜은..
1) B16F1 Cell을 10%FBS DMEM 배지로 37℃ 5% Co2 Incubator 배양 유지 한다.
2) 시험을 위하여 일정한 수의 세포(1X10개)를 6well Plate 에 배양하여 세포의
부착을 확인한 후, 세포배양액에 일정한 농도의 샘플을 처리 하여 2~3일
동안 배양 한다.
* MTT Assay 후에 독성을 확인하여 농도를 결정 한다.
* 희석하여 Sampling ( 1/20, 1/10, 등으로 희석)
3) 배양액을 제거한 후 PBS1X 로 세척하고 T/E or Cell Scraper 이용하여
세포를 수확한다.
4) 2500rpm 5min 원심분리 하여 세포의 pellet을 얻은 후 색깔을 확인하고
1N NaOH 100ul 에 녹이고 37℃ Incubator에서 Overnight 한다.
* 1N NaOH 200ul + DMSO 100ul + D.W 700ul = Total 1ml
5) Overnight 후에 475nm에서 흡광도 측정한다.
6) Melanin Standard 에 대입하여 멜라닌 양을 계산하고 멜라닌 세포의
Total Protein 양 또는 세포수로 값을 보정하여 Protein 당 Melanin양
으로 표시 한다.
☑ Melanogenesis inhibition(%) = [(A-B)/A]X100
A: Control의 멜라닌 양 / Protein 양
( Control : 샘플을 처리하지 않고 배지에서 정상적 으로 자란 Melanocytes )
B: 각 sample 처리한 멜라닌 양 / protein 양
여기서 제가 헷갈리는 것은 4번과정에서 어느분은 DMSO 에 녹이것이라고 하고
어는분은 NaOH 에 녹이는 것이 맞다고 하고..어느것이 맞는 것인가요?
아님 둘가 맞는 것인가요?
그리고 아시는분이 세포에 셈플 처리하고 하루만 배양 해도 inhibition 이 나온다고
하시면서 굳이 2~3일 할필요는 없다고 하시는데..
맞는 말인가요??
초보적인 질문이지만 답변 부탁드립니다.
- melanin
- inhibition
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 1
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답변
장성재님의 답변
2007-09-03- 0
멜라닌 연구를 하지는 않습니다만, 도움이 될까해서 한자 적어봅니다. 실험에 있어서 control(기준)이 가장 중요하답니다. 정량을 하기 위해서는 그에 따른 기준이 되는 표준(standard)도 물론 중요합니다. 따라서 세포를 용해시키는 데에 NaOH나 DMSO 모두 사용 가능하다고 볼 수 있지요. 세포와 멜라닌을 완전히 용해시켜 세포 내부의 멜라닌을 측정할 수 있으면 되니까요. 그리고 표준 시료와 기준 실험의 준비를 같은 용제를 사용한다면 실험의 상대적 차이를 구별하는 데에 무리가 없을 것으로 보입니다. 그리고 실험에 사용하는 시료(저해제)의 종류에 따라 역가가 높은 물질의 경우 짧은 시간에도 효과를 보이는 경우가 있으므로 반응의 적정선은 역시 기준 실험을 통하여 측정하는 것이 좋을 듯 싶습니다. 실험 방법은 스스로 개발하고 변형 시킬 수 있습니다. 단, 표준 프로토콜이 있을 경우 그것에 따라야 합니다. 자료를 첨부하니 참고 바랍니다.