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Bacillus의 생화학적 동정을 하려고 하시는 것 같군요. 최근에는 키트를 이용하여 간단히 동정이 가능하니 참 좋군요. 제가 공부할 때는 물론 키트도 있었지만, 비오메리흐(Biomerieux)의 키트는 주로 병원이나 국가의 연구기관에만 있었던지라 사용해 본 적은 없습니다. 직접 교과서 (Bergey's manual)에 나온 방법을 이용하여 배지를 직접 만들어서 생화학적 동정을 했던 것 같군요. 비오메리흐(Biomerieux)의 홈페이지에 들어가니 균종에 따라 상당히 많은 종류의 키트가 있더군요. 아래와 같습니다. 참고하시길... 단 두가지의 효소 활성만을 측정하실 거라면 키트를 사실 필요없이 교과서를 참고로 직접 배지를 제조한 후 측정 하실 수도 있습니다만, 역시 논문에 실으실 때는 현재 일반적으로 사용하는 신뢰성이 높은 방법을 사용하시는 것이 좋겠죠. 그리고 Bacillus의 경우는 말그대로 그람 염색의 경우 양성 반응을 나타냅니다. Bacillus의 경우 배양 조건에 따라 쉽게 포자를 형성하므로 포자 염색법으로 확인 가능합니다. 교과서를 참고하세요. API Products 1. API Gram-Negative Identification - API 20E Species/subspecies identification of Enterobacteriacae and group/species identification of non-fermenting gram-negative bacteria - API Rapid 20E 4-hour identification of Enterobacteriaceae - API 20NE 24-48 hour identification of gram-negative non-Enterobacteriaceae - API NH 2-hour identification of Neisseria Haemophilus and Branhamella catarrhalis 2. API Gram-Positive Identification - API Staph Overnight identification of clinical staphylococci and micrococci - RAPIDEC Staph 2-hour identification of the commonly occurring staphylococci - API 20 Strep 4 or 24-hour identification of streptococci and enterococc - API Coryne 24-hour identification of Corynebacteria and coryne-like organisms 3. API Anaerobe Identification - API 20A 24-hour idetification of anaerobes - Rapid ID 32A 4-hour identification of anaerobes 4. API Yeast Identification - API 20C AUX 48 to 72-hour identification of yeasts 5. Others - API 50 CH Performance of carbohydrate metabolism tests - API ZYM Semiquantitation of enzymatic activities

ID32E kit보다는 API50CHB를 사용하는것이 좋습니다. 그리고 그 결과를 완전히 믿을 수가 없기 때문에 검정시험을 다시 한번 해보시는게 좋습니다. 그리고 실험법은 kit를 구입하실때 manual을 함께 달라고 하시면 됩니다. Bacillus sp. 중에서 일부는 API 50CHB로 구분이 잘 되질 않습니다. (Bacillus cereus group 이라고 하는애들 입니다. ) Bacillus cereus group은 B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis로 구성되어있으며, API kit를 이용했을 경우에는 각각의 종들에 대해서 각각 몇%의 일치도를 보이는지 표시하고 있지만 믿을 수가 없습니다. 그리고 이들 Bacillus cereus group은 16s rDNA sequence 분석에서도 잘 구분되지 않을 때가 있습니다. 이들에 대한 구분방식은 질병관리본부 간행물자료실에 있는 병원성미생물검사 를 download해서 참고하세요. 혈액배지에서의 용혈현상 등을 이용해서 구분하는 방식이 있는데... 너무 오래되서 기억이 나질 않네요... Bacillus sp. 에 대한 gram staining을 할때 항상 양성의 결과를 나타내지 않습니다. Bacillus sp. 의 생육상태가 좋을 경우에는 사진에서 보는것같은 Gram positive를 나타내는데, 균주의 배양상태가 좋지않을 경우에는(너무 오래배양했을 경우도 포함됩니다) 음성처럼 나타나기도 합니다. 그람염색도중에 탈색과정을 너무 과도하게 수행할 경우에도 음성처럼 나타나기도 합니다. 참고로 제가 Bergey's manual of systematic bacteriology 1st에 나와있는 자료와 Bergey's manual of determinative bacteriology 9th에 나와있는 자료를 모아서 만든 동정표를 올립니다. 참고하세요. 원래 Bacillus sp.는 Bergey's manual of systematic bacteriology 1st에는 34개 종으로 구성되어 있었는데.... 이것들이 점차로 재분류가 되면서 Genus name들이 조금씩 바뀌었습니다. 예로 들면 일부 Bacillus sp.가 Penibacillus sp., Geobacillus sp. 등으로 Genus name이 바뀌었습니다. >16S rDNA 결과 Bacillus 종으로 확인되었습니다. >그래서 균의 생화학 특성 중, oxidase와 catalase 특성 조사를 하려고 하는데 >Kit를 사용하더라구요. kit 를 사용해서 실험하는 방법을 구하고자 합니다 > >그리고 API50CHB 및 ID32E kit 둘 중에서 꼭 API kit를 사용해야 하나요? >Bacillus 종일 경우, 그람 염색 결과가 항상 양성으로 동일한 건가요? >

>16S rDNA 결과 Bacillus 종으로 확인되었습니다. >그래서 균의 생화학 특성 중, oxidase와 catalase 특성 조사를 하려고 하는데 >Kit를 사용하더라구요. kit 를 사용해서 실험하는 방법을 구하고자 합니다 > >그리고 API50CHB 및 ID32E kit 둘 중에서 꼭 API kit를 사용해야 하나요? >Bacillus 종일 경우, 그람 염색 결과가 항상 양성으로 동일한 건가요? > 위의 두 테스트는 가장 기초적인 실험으로 굳이 비싼 키트 사서 할 필요 없습니다. 제가쓰는 아래의 방법을 추천합니다. oxidase test 1. N, N, N', N'-tetramethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride (oxidase) powder를 멸균된 DW (약3ml)에 소량 섞은 후 녹인다 (냉장고에서 1달동안 보관가능). 2. petridish 내의 filter paper에 Oxidase 용액을 두세방울을 떨어뜨린 후 고체 배지에서 자란 cell을 loop(swap)를 이용해 조금 떼어낸 후 filter paper에 찍으면 swap에 15초내에 blue-purple 색을 나타내는 경우 positive 3. 오래 두는 경우 negative가 positive로 변할 수 있으며 이는 false reaction임 4. 하지만 경험상 여러번 반복해야 blue-purple 색이 나오는 경우가 있음. 그 경우 positive로 처리 5. 뭉친곳에서 blue-purple 색이 나타는 경우 특히 여러번 반복하고 blue-purple 색이 조금이라도 나타나면 positive로 처리 Catalase test 1. 3% hydrogen peroxide 용액제조 2. 용액을 한두방울 떨어뜨리고, cell의 한 루프 정도를 용액에 희석시킨다. 3. 거품이 발생하면 positive 그람염색의 경우, Bacillus는 대부분 그람 양성이나, 일부 균주의경우 음성 균주도 있으므로 주의해야 합니다. 도움이 되시길..