2007-10-11
org.kosen.entty.User@4a3ffc0a
황희선(elmo1218)
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RINm5F cell의 을 하려고 하는데 형광이 잘붙지 않아서 그런지
inslin stainig이 잘되지 않네요..
전 cover glass를 사용하지 않았구요 바로 plate에 했습니다..
제가 사용한 방법은
4% p-formaldehyde,
washing with PBS 3번
10% nomal blocking serum in PBS 30분 반응시켰음.
washing with PBS 5분씩 3번
Primary antibody(Insulin A)를 PBS with 1.5% nomal blocking serum에 1:100으로 희석하여 사용. 그리고 12시간4도씨에서 반응시켰음
washing with PBS 5분씩 3번
Secodry antibody(Insulin A)를 PBS with 1.5% nomal blocking serum에 1:200으로 희석하여 사용.그리고 2시간 반응시켰음.
washing with PBS 5분씩 3번
FITC를 PBS에 1:100으로 희석하여 사용. 그리고 20분 반응시켰음.
형광현미경 관찰..
여기까지가 제가 사용한 방법인데 어디서 뭐가 잘못됐는지 어떤방법으로 해야 staining이 잘되는지 좀 가르쳐주세요..
- insulin stainig
- RINm5F cell
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답변 3
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답변
장성재님의 답변
2007-10-11- 0
마지막에 FITC를 그냥 반응시키신 것 같은데 FITC나 기타 형광성 물질이 conjugation된 secondary antibody를 사용하시는 것을 잘못 기술하신 것은 아닌가요? FITC를 그냥 세포에 처리한다고 해서 특정 부분이 염색되는 것은 아니므로... 아시겠지만, secondary antibody는 insulin에 대한 사용하신 primary antibody에 대해 특이적으로 반응하는 것을 사용하셔야 합니다. (mouse,rabbit, goat, chicken 등등 primary antibody를 생산하는 시스템은 많으므로) 기술하신 방법이 맞다면, 위에 제가 쓴 점들에 대해 다시 한번 검토해보시길... blocking은 혈청 이외에 skim milk나 gelatin, 또는 시판되는 제품을 사용하기도 한답니다. 그리고 세밀한 관찰을 위해서는 역시 cover glass 위에 고정하신 후 염색하시는 것이 좋겠죠... -
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주영락님의 답변
2008-04-21- 0
조직에 항체를 침투시키기위해 triton이나 tween을 사용하셨나요 조직에 침투도를 증가시키면 항체는 조직 속으로 더 잘 침투해서 염색이 용이합니다. 그리고 1차항체를 투입할 때, triton을 같이 사용하셨는지, normal serum을 사용하셨는지 확인해보세요. 1차항체 처리시는 serum을 농도별로 조건을 찾아 같이 처리하는게 일반적인 방법입니다. background labelling을 방지하는 역할을 하거든요 buffeer는 pbs 말고 0.1M pb나 0.25M tris를 사용해보세요. 아무래도 pbs는 삼투압뿐 아니라 세포이온농도에도 관여하기 때문에 그렇지 않은 buffer를 사용하시는게 좋을 듯 싶습니다. > > > -
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주영락님의 답변
2008-04-21- 0
동물을 죽이자마자 실험을 하셨는지, 아니면 오래 보관하고 실험을 하셨는지 궁금합니다. 물론 세포에 따라 다르겠지만 제가 연구하는 신경세포의 경우 물론 제 경우 실험을 했을 때 오래된 조직은 soma만 보이고 dendrite는 잘 관찰되지 않더라구요. 그래서 차라리 조직을ㄹ 오래 보관시킨 후 실험할 것 같으면 영하 70도에서 보관을 하시는게 좋을 것 같습니다. 그리고 항체농도를 좀 더 높여보세요. buffer양을 줄이고 , 항체사용량은 동일하게 해 보실수도 있을 것 같아요