KOSEN 한인과학기술자네트워크

FITC 등의 형광성 물질을 단백질과 결합 시키는 반응은 단백질 내의 free-amino group (lysine의 side chain, amino termini)과 각각의 형광성 물질의 반응성 잔기 간의 결합 반응에 의한 것 입니다. FITC (fluorescein-5-isothiocyanate)의 경우 isothiocyanate 기가 반응기로써 HN-CS bond를 형성하는 반응에 의해 단백질과 결합하게 됩니다.(그림1. 참고) FITC 이외에 Alexa488, Alexa594 등의 succinimidyl ester 반응기를 갖는 형광성 물질도 단백질의 형광성 라벨링에 자주 사용되는 물질들이다. 이때의 반응은 HN-CO 결합에 의합니다. (그림2. 참고) 항원 단백질을 sepharose에 결합시켜 만드는 특정 항체-분리용 항원 칼럼의 제작에 주로 사용하는 NHS (N-hydroxysuccinimide)-activated column 역시 같은 원리를 이용한 것이라고 보시면 됩니다.

>안녕하세요~ > >단백질에 FITC와 같은 tagging을 해서 판매하는 경우가 많은대요. > >제가 알고싶은 것은 단백질-FITC tagging을 어떻게 시키는지가 궁금합니다. > >원리부터 가르쳐주셨으면 합니다. > >제가 이쪽을 전혀 알지를 못하거든요. > >읽어주셔서 감사합니다. 3-23. FITC-Labeling Materials : • FITC (fluorescenin isothiocyanate) ; amine reactive probe. Amine-reactive reagents react with non-protonated aliphatic amine groups, including the amine terminus of proteins and the ε-amino group of lysines. • 20 mM sodium bicarbonate buffer pH8.5 • 1 M ethanolamine • sephadex G-25 (gel filtration resine) Mathod : 1. Dissolve FITC in DMSO ( Dimethylsulfoxide ) 10 mg/ml. 2. Dilute FITC and peptide in 20 mM sodium bicarbonate buffer pH 8.5 to each stock solution 1 mg/ml (each final volume 500µl) 3. Mix FITC solution and peptide solution and then incubate at rotary mixing for 4hr in the dark at room temperature (conjugation step) 4. Add 200 µl of 1M ethanolamine, then incubate at rotary mixing for 2hr in the dark at room temperature (reaction step) 5. Road the mix solution on gel filteration colume ( Sephadex-G25) with 20mM sodium bicarbonate pH 9.0 buffer to separate the conjugate from unreacted labeling reagent 6. Collect the fraction 7. Lyophilize each fraction 8. Dissolve each fraction with D.W. 9. Confirm FITC labeled peptide by confocal laser scanning microscopy ( excitation maximum; 494nm ) 3-24. Rhodamin Labeling with Peptide Materials : • Rhodamin • 100 mM Ammonium bicarbonate pH 9.0 • sephadex G-15 (gel filtration resine) Mathod 1. Dissolve Rhodamin in DMSO (Dimethylsulfoxide) 10 mg/ml 2. Mix 250 μl of 10 mg/ml rhodamin and 50 μl of 100 mM ammonium bicarbonate pH9.0 3. Spin down at 12000 rpm for 10 min to remove the precipitation 4. Dry the peptide (100 μg) and dissolve the peptide ( 100 μg) with 50 μl of 100 mM ammonium bicarbonate pH 9.0 5. Mix 50 μl of peptide solution and 150 μl rhodamin solution (final volume 200 μl) 6. Rotate the mix solution for 2 hr at room temperature 7. Spin down at 12000 rpm for 10 min 8. Road the supernatant on gel filtration column (Sephadex G-15) or inject the supernatant on HPLC 9. Collect the fraction 10. lyophilize 11. dissolve each fraction with appropriate buffer 12. determin protein amount by BCA method