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지식나눔

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E.coli 발현벡터 관련 문의

2007-10-20 org.kosen.entty.User@72a7adbd 최재훈(cjh0508)
  • 1
pKK223-3 (Pharmacia) 벡터 가지고 계신분... Pharmacia에서 판매하던 벡터인데 단종이 되었네요. 혹시 가지고 계시면 얻을 수 있었으면 합니다. 이거 말고라도 tac promoter를 가진 E.coli expression vector의 종류나 구매방법에 대해 아시는 분들의 코멘트도 기다릴께요. 그리고 한가지 더... Antibody Fab를 E.coli에서 생산을 하려고 하는데요... Periplasmic expression을 할 예정이구요... 그런데 Light chain과 heavy chain을 하나의 promoter아래에서 발현되도록 bicistronic하게 사용하는 것이 좋을까요 아니면 dual promoter system을 사용하는 것이 좋을까요? 두 chain의 발현정도가 큰 영향을 미칠 것 같다는 생각이... 문헌도 찾기 어렵고 해서 혹시 경험해보신 분이 계시면 조언을 부탁드립니다. 미리 감사드립니다.
  • pKK223-3
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답변 1
  • 답변

    장성재님의 답변

    2007-10-20
    • 0
    Fab fragment를 E.coli에서 발현하여 생산하는 시스템을 개발하려고 하시는 것 같군요. 단지 학술 연구를 위한 것이 아닌 기업체에 소속되어 있으신 경우에는 특허 관계 등을 고려하시길 바랍니다. backbone 만을 사용하고 다른 기능을 첨가하는 식으로 발명성을 추가하셔서 개발을 하셔야 하겠죠. 물론, tac promoter를 이용한 E.coli 발현계 벡터는 초기에 많이 사용하던 것이 pKK223이었습니다만 현재는 다른 여러 가지 벡터 등이 시판되고 있습니다. 그다지 변화된 것은 없다고 여겨집니다만... 그런데 E.coli에서의 발현계는 거의 대부분 inclusion body의 형태로 만들어져 refolding 등의 과정을 거쳐야 하고 glycosylation 등의 문제점 등, 최근에는 humanized IgG kimera 단백질들은 동물세포에서 발현시키는 시스템으로 거의 바뀌어진 것이 현실입니다. 치료제가 아닌 assay계를 검토하고 계시다면 가능하겠지만.... 단순히 단백질 생산이 높은 E.coli용 벡터는 pRSET (Invitrogen)의 경우도 제 경험으론 생산량은 무척 높은 편입니다만...역시 대부분이 inclusion body로 생산되기 때문에 나중에 refolding 과정에서 수율이 급격히 떨어지기도 합니다. refolding 수율을 올리기 위해 PDI (Protein disulfide isomerase)나 계면활성제 등을 이용한 방법 등도 개발되어 있습니다. 예전에는 pEE 계열 (Lonza)의 벡터를 이용한 heavy chain과 light chain을 따로 발현시켜 self assembly를 유도하여 chimeric IgG를 동물 세포에서 생산하는 연구들이 있기도 합니다. Antibody fusion proteins (Wiley-Liss publication)라는 서적도 있으니 참고하시길 바랍니다.
    답변수정
    Fab fragment를 E.coli에서 발현하여 생산하는 시스템을 개발하려고 하시는 것 같군요. 단지 학술 연구를 위한 것이 아닌 기업체에 소속되어 있으신 경우에는 특허 관계 등을 고려하시길 바랍니다. backbone 만을 사용하고 다른 기능을 첨가하는 식으로 발명성을 추가하셔서 개발을 하셔야 하겠죠. 물론, tac promoter를 이용한 E.coli 발현계 벡터는 초기에 많이 사용하던 것이 pKK223이었습니다만 현재는 다른 여러 가지 벡터 등이 시판되고 있습니다. 그다지 변화된 것은 없다고 여겨집니다만... 그런데 E.coli에서의 발현계는 거의 대부분 inclusion body의 형태로 만들어져 refolding 등의 과정을 거쳐야 하고 glycosylation 등의 문제점 등, 최근에는 humanized IgG kimera 단백질들은 동물세포에서 발현시키는 시스템으로 거의 바뀌어진 것이 현실입니다. 치료제가 아닌 assay계를 검토하고 계시다면 가능하겠지만.... 단순히 단백질 생산이 높은 E.coli용 벡터는 pRSET (Invitrogen)의 경우도 제 경험으론 생산량은 무척 높은 편입니다만...역시 대부분이 inclusion body로 생산되기 때문에 나중에 refolding 과정에서 수율이 급격히 떨어지기도 합니다. refolding 수율을 올리기 위해 PDI (Protein disulfide isomerase)나 계면활성제 등을 이용한 방법 등도 개발되어 있습니다. 예전에는 pEE 계열 (Lonza)의 벡터를 이용한 heavy chain과 light chain을 따로 발현시켜 self assembly를 유도하여 chimeric IgG를 동물 세포에서 생산하는 연구들이 있기도 합니다. Antibody fusion proteins (Wiley-Liss publication)라는 서적도 있으니 참고하시길 바랍니다.
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