2007-11-01
org.kosen.entty.User@64812bd3
이현기(lhg5439)
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band 가 etbr staining 한 결과와 동일하게 나오는 군요
non-specific 하게 hyb가 되는 것 같군요 18s, 28s band가 모두 확되는군요
고수님들의 많은 조언 부탁드립니다.
- northern
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전현주님의 답변
2007-11-02- 0
>band 가 etbr staining 한 결과와 동일하게 나오는 군요 >non-specific 하게 hyb가 되는 것 같군요 18s, 28s band가 모두 확되는군요 >고수님들의 많은 조언 부탁드립니다. > 제 생각에는 probe가 너무 센 것이 아닌가 싶습니다. 그리고 얼마나 오래 expose한 건지 모르겠지만,보통 18s와 28s가 보일 정도인데 자기 band가 안보이면 그 sample에서 그 gene이 발현하지 않거나 아주 적은양 발현하는 것으로 보입니다. 그 유전자 발현이 확실한 positive control sample을 함께 loading해서 확인하는 것이 중요합니다. 만일 그렇게 했는데도 같은 결과라면 probe만들 때 사용한 template DNA를 다시 확인해 보는 것이 좋겠습니다. 바른 sequence가 아닐 가능성이 크니까요. Norther은 일반적으로 PCR보다 sensitivity가 낮은 단점이 있습니다. 때로 northern에서 보이지 않던 signal이 RT-PCR에서는 보다 확실하게 나타나는 경우도 있습니다. 만일 발현이 아주 적다면 northern보다는 RT-PCR을 이용해 보세요. -
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전현주님의 답변
2007-11-03- 0
>band 가 etbr staining 한 결과와 동일하게 나오는 군요 >non-specific 하게 hyb가 되는 것 같군요 18s, 28s band가 모두 확되는군요 >고수님들의 많은 조언 부탁드립니다. 칭찬 감사합니다. 그런데 다음단계로 접근하시는 것이 그렇게 하시면 안 될 것 같습니다. 1. Northern이나 Southern에서는 보통 온도 조절은 하지 않습니다. Hybridization buffer에 따라 온도가 달라지기는 하지만 일단 결정된 (프로토콜에 나와있는 온도)는 조절하지 않는 것이 보통입니다. 만일 Northern을 그 실험실에서 계속 쓰던 것이 아니고, 새로 시도하시는 것이라면 프로토콜을 몇개 더 확인해 보시는 것이 좋겠습니다. 만일 사용하시던거라면 온도 조절하실 필요는 없습니다. GAPDH 등의 probe로 일단 system에 문제가 없는지 확인하는 것이 좋겠습니다만, 이것도 실험실에서 계속 나오던 거라면 그냥 넘어가도 되겠습니다. 2. probe의 양이 많은 것 같기는 하지만, 더 중요한 문제는 probe의 specificity입니다. 18S와 28S에 그렇게 강하게 붙었다는 것은 그 probe이 specific한지 먼저 체크를 해 보셔야 합니다. 일단 이론적으로 probe의 길이가 충분한지 (400-600 bp정도), 또 BLAST에 넣어서 homology search를 해 보셨을 때 다른 gene과 homology가 없이 그 gene에 specific한지 먼저 확인하셔야 합니다. 3. Probe이 specific한지 먼저 이론적으로 확인을 하시고, 그러고도 실험적으로는 안되는 수가 있으니, 그 gene의 발현이 증가되어 있는 조건을 찾아서 positive control을 넣어 확인을 꼭 하셔야 합니다. 말씀드린대로 norther은 sensitivity가 그렇게 좋지는 않습니다. 만일 유전자의 발현이 소량이라면 안 잡히는 수도 있습니다. (아니면 발현이 없을 수도 있지요) 그러니까 positive control이 꼭 있어야겠지요. 이런 식으로 접근을 해보시는 것이 좋겠습니다. 현 상황에서 probe의 양만 줄인다거나, 온도 조절을 별 도움이 안될 것 같습니다.