KOSEN 한인과학기술자네트워크

말씀하시는 단백질의 농도는 cell lysate의 total protein의 농도를 의미하는 것 같군요. Western blotting시 막으로의 단백질 전달 효율에서 약간의 차이가 발생할 수 있습니다. 또한, 세포의 상태에 따라서 세포 내의 전체 단백질 당 actin의 비율이 변하기도 하므로 충분히 있을 수도 있는 상황입니다. 논문들을 참고하시면 아실 수 있겠지만, 전체적으로 유사한 값을 나타내는 것 뿐 정확히 일정한 수치의 actin band를 갖는 테이터는 그리 흔치 않습니다. 그리고 이때 대부분의 결과치에서 보면 알 수 있듯이 상대적인 target protein의 양을 측정하기 위해서 비교 콘트롤이 되는 actin이나 GAPDH의 양을 측정하는 것 이니까요. 또 한가지 단백질의 측정 방법은 여러가지가 있습니다만...저의 경우에는 BCA assay를 추천합니다. Bradford법 보다 surfactant에 대한 흡광도의 영향이 적으므로... 마지막으로 막으로의 단백질 전달 효율을 미리 측정하시려면, transfer 후에 Ponceau S라는 시약으로 막을 염색해보시면 대략 측정이 가능합니다. 물론 Ponceau S는 blocking 과정에서 깨끗히 제거됩니다.

>전기영동을 하기 전에 단백질을 추출하여 흡광도를 찍지 않습니까..그때 저같은 경우는 bradford 900ul에 sample10ul을 넣고 흡광도를 잽니다.흡광도 결과가 50.5638ug/ml이 나왔고 그리고나서 만약 전기영동을 할때 40ug의 농도로 로딩을 하고 싶다면 계산을 10:50.5638=x:40 이렇게 계산을 합니다. 그럼 7.9ul의 sample과 sample buffer을 같이 넣고 로딩을 합니다. 그러나 항상 western blot을 하고 b-actin을 찍으면 항상 일정하게 나오질 않습니다. 흡광도를 측정하면 바로 단백질 농도가 나오는 것은 standard curve를 미리 그렸기 때문인가요? 그냥 궁금해서요.... 저도 그런 경우가 있어서 고생을 좀 했었는데요.... 1. 이론적으로는 설명하기 어려운데, cell lysate에 있는 단백질은 centrifuge에 의해서 좀 가라앉나봐요. (이론적으로는 protein이 solution에 고르게 녹아 있어야 할 것 같은데....) 그래서 일단 농도를 재고 얼렸다가 다시 녹여서 잠깐 spin하고 그러는 과정에서 농도가 달라지더라구요... 그래서 저는 우선 농도를 재기 전이나, sample을 loading하기 위새 다른 튜브로 옮기기 전에 다음과 같이 항상 일정하게 합니다. 1)일단, 잠깐 spin을 해서 벽에 묻은 lysate를 모은 후, 2)튜브 중간쯤을 잡고 vortex를 합니다. 튜브 뚜껑부위를 잡고하면 너무 많이 튀거든요. vortex할 때 손으로 잡은 부위까지만 solution이 올라오거든요. 3) 얼음위에 잠깐 그냥 둡니다. 얼음위에 두는 건 proteinase나 phosphatase 등의 활성을 막기 위해서지요. 그냥 오래 말고 그냥 다음 과정하기 전에 잠깐 두어서 lysate가 흘러내리게요 4) sample을 표면에 tip을 살짝 대고 떠 냅니다. 지금까지 이 방법을 고수하고 있습니다. 실험실에서 다른 사람이 님과 같은 문제가 있을 땐 이 방법을 알려줍니다. 2. 경우에 따라서... 처리한 시약이나 처치에 따라서 정말로 actin의 양이 변하는 경우도 있습니다. 그런 경우에서 아무리 신경을 써도 당연히 actin의 양이 다르게 나오지요.... 혹은 실험실에 GAPDH 항체가 있다면, 혹은 빌릴 수 있다면, 간단하게 사용했던 membrane을 이용해서 GAPDH 등 다른 house keeping단백질 양을 보는 것이 좋습니다. GAPDH로 해도 actin의 양과 같이 나온다면 확실하게 sample을 다룰 때의 문제이니 위의 방법을 따르시구요. GAPDH에서 일정하게 나온다면 님의 방법에는 문제가 없고 세포 자체의 문제이니 actin을 쓰지 말고 GAPDH로 바꾸면 됩니다. 어떤 경우에는 GAPDH의 양을 변하게 하는 처치도 있지만, actin과 GAPDH에 공통적으로 영향을 주는 처치는 많지 않을겁니다. 그럼 사소하지만 사람 힘들게 (사실은 미치게) 하는 문제 잘 해결하시기 바랍니다.

>전기영동을 하기 전에 단백질을 추출하여 흡광도를 찍지 않습니까..그때 저같은 경우는 bradford 900ul에 sample10ul을 넣고 흡광도를 잽니다.흡광도 결과가 50.5638ug/ml이 나왔고 그리고나서 만약 전기영동을 할때 40ug의 농도로 로딩을 하고 싶다면 계산을 10:50.5638=x:40 이렇게 계산을 합니다. 그럼 7.9ul의 sample과 sample buffer을 같이 넣고 로딩을 합니다. 그러나 항상 western blot을 하고 b-actin을 찍으면 항상 일정하게 나오질 않습니다. 무엇이 문제 인가요? 사소하지만 무엇보다 중요한 것은 측정 시료를 하나만 하지 말고 세 개 이상하여 평균 값을 내어 농도를 계산하시기 바랍니다.