2007-12-14
org.kosen.entty.User@24233801
이희진(iheeihee)
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혈액을 분리할때 백혈구 중 mononuclear cell을 분리하는 방법으로
Histopaque-1077이라는 sigma 제품을 사용하였는데 이것을 사용하면
적혈구는 아래로 가라앉고 윗부분에 mononuclear cell 층이 생긴다고
했는데 해본 결과 적혈구는 가라앉았으나 상등액 부분에 뚜렷한 층은 생기
지 않고 그냥 뿌연 정도 생기다가 시간이 지나면 그것도 없어집니다.
원래 mononuclear cell층이 정말 희미할 정도로 뿌옇게 보이는것인지
그리고 시간이 지나면 없어지는 것인지 궁금합니다.
그리고 그것이 아니라면 어떻게 해야 확실하게 mononuclear cell층을
분리할 수 있는지 알고 싶습니다.
- monocyte
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답변 2
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답변
김윤상님의 답변
2007-12-15- 0
기본적인 내용들은 님께서 충분히 알고 계시리라 믿습니다만... 몇 가지 가능성으로는,... 원심분리를 하신 후에 그 층이 보이지 않는다는 이야기는, 시료에 mononuclear cells이 많지 않다는 뜻이 됩니다. 물론, 제대로 layering 을 하지 않았을 때에도 그런 일이 일어날 수 있지만, 애초에 시료에 세포수가 적었거나 (채취한 혈액양이 너무 적거나 응고가 일어난 경우), 원심분리를 충분한 시간 동안 충분한 xg 만큼 (대개 상온에서 30분, 400 xg) 하지 않았을 가능성을 생각해 볼 수 있습니다. 그리고, 아시겠지만, polystyrene tube는 사용하시지 말아야 합니다. 저의 경우는, 한 번 사용했던 polypropylene tube (50 ml conical tube)를 깨끗하게 씻은 다음 멸균해서 썼습니다. 또, powdered gloves를 사용하지 않아야 하며, Histopaque은 물론 상온으로 미리 준비해 두어야 합니다. 도움이 되었으면 합니다. -
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박세아님의 답변
2007-12-16- 0
시료의 양을 얼마나 하셨는지 모르겠지만 30ml 정도를 분리하여도 아주 뿌연층이 생깁니다. 이것보다 더 적은양을 분리를 하면 거의 보일듯 말듯 합니다. 원심분리 후 바로 위의 혈장을 조심스럽게 제거하는데 백혈구층의 윗부분의 혈장은 조금 남겨놓습니다. 그리고 남은 혈장을 빨아들이면서 백혈구층을 얻는데 이때 Ficoll의 일부가 같이 빨려오게 됩니다. 이것을 다른 튜브로 옮긴다음 PBS로 washing을 세번하셔야 하는데 처음 PBS를 넣을 때는 많이 첨가해야합니다. Ficoll이 들어가 있기 때문에 Ficoll 성분을 많이 희석해 줘야 세포가 down이 됩니다. 원심분리 후 즉시 이 작업을 하셔야 합니다. Ficoll에 오래 두게되면 damage를 입게 됩니다. 아마 damage 탓으로 세포가 death한 것으로 보입니다.