2007-12-19
org.kosen.entty.User@2f6c72d4
윤재영(yjyoung1)
- 2
안녕하십니까?
최종 산물이 형광을 띄는 모델 효소 시스템을 이용하여 바이오칩 상에서 enzyme kinetics를 분석하려 합니다. 제가 사용하려는 효소는 diaphorase(Sigma, D5540) 입니다. NADH 존재하에 resazurin이 rosorufin으로 변하면서 형광 시그날을 보이는 시스템입니다.
제가 궁금한 것은 다음과 같습니다.
1. 형광의 세기 분석을 통하여 최종 산물의 몰농도를 계산할 수 있는가?
2. 효소는 5~20 unit/ml입니다. 1unit의 효소의 몰 농도는 얼마인가?
3. 1이나 2의 정보 없이도 Km이나 Vmax(product/time)를 결정하는데 문제가 없는가?
등입니다.
그리고 형광 분석을 통한 효소 동력학을 분석한 참고자료가 있으면 부탁드립니다. 내용 상으로는 그럭저럭 이해는 했지만 실제 분석에 적용하려니 많은 어려움을 겪고 있습니다.
미리 감사드립니다.
꾸벅
- enzyme kinetics
- Fluorescence
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
유용규님의 답변
2007-12-20- 0
형광의 세기 분석을 통한 목표산물의 정량은 가능할 것같지만... 농도범위에 따른 오차는 감안하셔야 할 것 같습니다. 미생물의 진단부분에서 항체의 양이 일정할 경우 목표물질의 양에 따라 반응하는 항체의 양이 다른데 이 반응항체에 결합되어있는 효소의 양에 따라서 효소에 의해서 발색이 되는 기질의 양이 달라지는(발색정도의 차이) 원리를 사용하는 것을 본 적이 있는데.... 목표물질의 농도 범위에 따라서 오차율이 급상승하는 것을 본 적이 있습니다. 그리고 효소에서 unit라는 단위는 1몰의 기질을 전환시키는 효소의 양으로 정의되는데..... 모든 효소가 다 활성을 가지는 것이 아니기 때문에.... 그것을 몰로 계산하시기는 어려울 듯 합니다. 제 경험으로는 동일한 종류의 효소(동일한 unit/ml을 표시)라도 회사에 따라서 조금씩 활성이 차이를 보이는 것을 경험했습니다. 어느정도의 범위에 대한 유동성은 생각하셔야 할 듯 합니다. 1번은 알아야겠지만... 2번의 경우 몰농도를 몰라도 어느정도 Km, Vmax 계산은 할 수 있을 듯 합니다. 실험을 통해서 사용하시는 효소가 목표기질의 양에 따라서 반응양상이 어떻게 되는지 직접 데이터를 만드셔야 할듯 하네요... >안녕하십니까? > >최종 산물이 형광을 띄는 모델 효소 시스템을 이용하여 바이오칩 상에서 enzyme kinetics를 분석하려 합니다. 제가 사용하려는 효소는 diaphorase(Sigma, D5540) 입니다. NADH 존재하에 resazurin이 rosorufin으로 변하면서 형광 시그날을 보이는 시스템입니다. > >제가 궁금한 것은 다음과 같습니다. >1. 형광의 세기 분석을 통하여 최종 산물의 몰농도를 계산할 수 있는가? >2. 효소는 5~20 unit/ml입니다. 1unit의 효소의 몰 농도는 얼마인가? >3. 1이나 2의 정보 없이도 Km이나 Vmax(product/time)를 결정하는데 문제가 없는가? >등입니다. > >그리고 형광 분석을 통한 효소 동력학을 분석한 참고자료가 있으면 부탁드립니다. 내용 상으로는 그럭저럭 이해는 했지만 실제 분석에 적용하려니 많은 어려움을 겪고 있습니다. > >미리 감사드립니다. > >꾸벅 -
답변
홍비학님의 답변
2007-12-25- 0
>안녕하십니까? > >최종 산물이 형광을 띄는 모델 효소 시스템을 이용하여 바이오칩 상에서 enzyme kinetics를 분석하려 합니다. 제가 사용하려는 효소는 diaphorase(Sigma, D5540) 입니다. NADH 존재하에 resazurin이 rosorufin으로 변하면서 형광 시그날을 보이는 시스템입니다. > >제가 궁금한 것은 다음과 같습니다. >1. 형광의 세기 분석을 통하여 최종 산물의 몰농도를 계산할 수 있는가? 일반적으로는 됩니다. 대부분의 효소활성을 측정하는 법이기도 합니다. 단, A=eCl에서 파장에 따른 e값을 정확히 알고 있어야 합니다. 보통 파는 물건이면 대개 알려져 있으므로 문제 없습니다. >2. 효소는 5~20 unit/ml입니다. 1unit의 효소의 몰 농도는 얼마인가? 모릅니다. 정확한 biochemistry를 하기 위해서는, 단백질의 몰농도를 별도의 방법으로 우선 정확히 정량할 필요가 있습니다. 대부분의 경우 효소의 양보다는 효소의 활성을 기준으로 실험하기 때문에 무시합니다만, Km이나 kcat 등을 말하기 위해서는 반드시 따로 단백질의 양을 재야만 합니다. 직접 뽑는 효소가 아니라 구매하시는 효소라면 유닛과 몰수의 관계가 lot나 제작사 별로 달라지기때문에 매번 측정하셔야 할 필요가 있습니다. 또한 구매한 효소라면 우선 순도부터 의심하고 실험하셔야 할 가능성이 높습니다. >3. 1이나 2의 정보 없이도 Km이나 Vmax(product/time)를 결정하는데 문제가 없는가? 못잽니다. 효소 농도와 substrate/product 농도를 모르면 LB 플롯을 못그립니다. 물론 Vmax는 그냥 유닛 단위로 계산해서 해도 되긴 합니다만 그렇게 하면 그리 정확한 데이터로 인정받지는 못합니다. kcat이나 kcat/Km을 말할 수가 없죠. >등입니다. > >그리고 형광 분석을 통한 효소 동력학을 분석한 참고자료가 있으면 부탁드립니다. 내용 상으로는 그럭저럭 이해는 했지만 실제 분석에 적용하려니 많은 어려움을 겪고 있습니다. 대부분 생화학책의 LB plot의 변형일 뿐입니다. 반응단계가 복잡하면 지저분해지지만, 다 무시하고 그냥 substrate -> product로 한 다음 그냥 계산하시면 됩니다. > >미리 감사드립니다. > >꾸벅