2008-01-04
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이희진(iheeihee)
- 2
Histopaque 1077을 사용하여 mononuclear층을 분리해여 PBS로 세번 세척후
RPMI(+FBS+gentamicin)으로 세포 배양을 하였습니다.
분명히 mononuclear cell을 확인할 수 있었고 증식하고 cell 크기가 커지
는 것도 관찰 되었습니다.
그런데 mononuclear cell만 보이는 것이 아니고 그것보다 크기가 작은
약간 검은색으로 보이는 작은 알갱이(동그란 모양) 같은 것들이 많이
떠 있었습니다.
그렇다면 그 작은 알갱이들이 깨끗하게 세척이 안돼 다른 혈액성분이
섞인 것인지 아니면 오염이 되어서 그런것들이 생긴 것인지 궁금합니다.
그리고 다른 혈액 성분이 생긴 것이라면 어떤 것들이 그런 모양을
나타내는 것인지 알고 싶습니다.. 깨끗하게 mononuclear cell만 분리하는
방법이 무엇인지도 궁금합니다.
- mononuclear
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답변 2
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답변
윤철희님의 답변
2008-01-04- 0
현미경 관찰이 가능하다면 일단은 크기가 어느정도 되는 박테리아 또는 세포(debris 포함) 일 것으로 생각됩니다. 오염되지 않은 상태라면 platelet일 가능성이 있을 것 같습니다. 세포 크기에 상관 없이 오염이라면.. 오염종류에 따라서 몇가지 확인이 필요합니다. Mycoplasma contamination은 세포성장을 느리게 하다가 심하면 배양을 할 수 없게 됩니다.. 이 경우라면 심각합니다.. Mycoplasma의 경우는 종류가 매우 많기는 하지만 KIT이 있어서 detection을 해 볼 수 있습니다. 사람, 소, 돼지의 경우 이런 오염원을 제공할 수 있습니다.. 배지의 색깔이 빠른 속도로 노란색이 되어지면(PBMC이기 때문에 10^6/ml정도에서 보통 3-4일 걸리는데 1일이나 1일 이내에) 오염을 의심하시면 됩니다.. microbial contamination인 경우에는 PBMC들이 반응을 하여 cytokine등을 활발하게 분비하게 됩니다.. 따라서 ELISA를 통해서도 확인이 가능합니다.. 좋은 실험 되세요.. >Histopaque 1077을 사용하여 mononuclear층을 분리해여 PBS로 세번 세척후 > >RPMI(+FBS+gentamicin)으로 세포 배양을 하였습니다. > >분명히 mononuclear cell을 확인할 수 있었고 증식하고 cell 크기가 커지 > >는 것도 관찰 되었습니다. > >그런데 mononuclear cell만 보이는 것이 아니고 그것보다 크기가 작은 > >약간 검은색으로 보이는 작은 알갱이(동그란 모양) 같은 것들이 많이 > >떠 있었습니다. > >그렇다면 그 작은 알갱이들이 깨끗하게 세척이 안돼 다른 혈액성분이 > >섞인 것인지 아니면 오염이 되어서 그런것들이 생긴 것인지 궁금합니다. > >그리고 다른 혈액 성분이 생긴 것이라면 어떤 것들이 그런 모양을 > >나타내는 것인지 알고 싶습니다.. 깨끗하게 mononuclear cell만 분리하는 > >방법이 무엇인지도 궁금합니다. > > -
답변
장성재님의 답변
2008-01-05- 0
위에 답변을 주신 분의 말씀대로 platelet일 확율이 높을 것으로 보입니다. 간단히 고정 후 DAPI나 Hoechst로 핵 염색을 해보시면 구분이 가능하실 겁니다. platelet은 핵이 없으므로 미생물이나 기타 세균에 의한 오염일 경우 핵이 염색되므로 형광현미경을 이용하여 쉽게 구분하실 수 있을 겁니다. 사용하신 Histopaque로 lymphocyte 세포의 분획을 분리하신 후 4-20% sucrose gradient로 한번 더 분리하실 경우 platelet의 contamination을 최소화 할 수 있습니다. Histopaque 한번으로 100% lymphocyte의 순수 분리는 불가능하답니다. 소량의 Granulocytes나 platelets의 오염은 감수하시는 것이 좋지요.