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안녕하세요. 실험하다 궁금한 점이 있어 이렇게 글 올립니다. 다름이 아니라 요즘 제가 siRNA oligonucleotide를 가지고 cytotrophoblast cell에 transfection하여 knock-down 정도를 확인하는데요, 생각보다 쉽지가 않네요. 제가 이것저것 찾아본 결과, 실험실마다 하는 방법이 약간씩 다르고 사용하는 농도도 천차만별이더라구요, 그래서 어떻게 해야할지 잘 모르겠습니다. 여태 제가 실험한 방법에 대해 말씀 드리자면, 우선, 1. siRNA_VEGF (wild type) / siRNA_VEGF (mutant) - 바이오니아에서 구입하였으며 stock 농도는 20nM 이며, 권장농도는 20-50pM 입니다. 2.siRNA_VEGF-R1/ siRNA_VEGF-R2 - ambion에서 구입하였으며 stock 농도는 20uM 입니다. 권장농도는 75pM 입니다. 3. siRNA_PlGF - Dharmacon 에서 구입하였으며, Stock 농도는 20uM 입니다. 권장농도는 100nM 입니다. 이런 조건에서 제가 농도계산을 잘못하여, VEGF의 경우는 농도를 낮게 적용하여 실험을 하였고 receptor의 경우는 농도를 훨씬 많이 사용하여 했음에도 불구하고 결과는 제대로 된 knock-down 효과를 보지 못했습니다. VEGF는 변화없었고, R1/ R2의 경우는 변화가 없거나 아주 미미하게 줄어든 것을 확인하였습니다. 실험 방법은 6well에 1x 10^5 cell를 seeding 후 24hr동안 incubation한 뒤 opti-MEM 배지로 바꿔주고 이에 lipofectamine 2000을 사용하여 transfection 하였습니다. siRNA oligonucleotide와 lipofectamine mixture를 cell에 떨어뜨린 뒤 24hr동안 배양하고 그 후 배지를 덜어낸뒤 complete 배지 2ml를 넣어 다시 24hr동안 배양하였습니다. 그 후에 cell harvest 하여 RT-PCR로 확인해보았는데 결과는 위에서 말씀드린대로 효과가 없었습니다. Transfection 후 cell를 관찰한 결과, cell 상태가 크게 변화된 것 없이 아주 쌩쌩하게 잘 자라더라구요, 어디서 문제가 있어 siRNA를 처리했음에도 불구하고 knock-down 되지 않았을까요?? 일차적인 문제는 농도가 제대로 처리되지 않아 제대로 효과를 볼 수 없었다고 생각되고요, (여기서 잠깐... 위에서 R1/ R2의 경우는 권장농도보다 약 20배 정도 더 처리했음에도 불구하고 효과가 없었는데 이건 왜 그런가요?? 흑흑...) 농도 문제 이외에 어떤 문제로 인해 결과가 예상과 어긋나는 걸까요?? siRNA 처리시간에 문제가 있는 걸까요?? 답답하기 그지 없습니다. 해결책이 있다면 답변 부탁 드릴게요~~ 그럼 즐건 하루 되세요~