2008-01-09
org.kosen.entty.User@4fc93157
김주희(jhhappy)
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35mer primer 14개를 사용해서 400bp 정도의 gene을 합성 하려고 합니다..
그런데.. 생각보다 쉽지는 않네요... 어디에서 문제가 있느건지...--;
gene synthesis를 할때 중요한 점 좀 가르쳐주세요...
아님 잘 나와 있는 논문이라도...
사용하시는 프로토콜을 가르쳐주시면 더욱 좋구요...^^
그리고 primer를 mixing 할때 30uM을 각각 넣으라고 하는데요... 100pmol primer를 얼마나 넣어야 39uM이 되는건가요? primer는 어떻게 농도를 계산하는지 모르겠습니다..
도와주세요...
- DNA synthesis..
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답변 3
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유용규님의 답변
2008-01-09- 0
100pmole일때 이것은 100uM(리터기준)이 되요 만약 ul당 10pmole이라면 이것은 10uM이 되는거구요 >그리고 primer를 mixing 할때 30uM을 각각 넣으라고 하는데요... 100pmol primer를 얼마나 넣어야 39uM이 되는건가요? primer는 어떻게 농도를 계산하는지 모르겠습니다.. > >도와주세요... > -
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유용규님의 답변
2008-01-11- 0
PCR 을 이용한 Template 합성에서 35mer 정도는 그리 긴건 아닌것 같습니다. 제가 알던 분은 80mer짜리를 이용하는 것도 봤거덩요.... primer를 이용하여 PCR을 진행한 후에 purification을 수행하지 않고 다시 2번째 primer를 이용해서 PCR을 수행할 경우에는 전단계에서 사용되었던 primer 단편에 의한 간섭이 있을 수 있으므로 꼭 PCR purification 을 수행하고 다음단계로 넘어가야 한다고 알고 있구요..... 각 단계마다 annealing 온도를 조절하면서 PCR 을 수행해야 하기 때문에 무지 까다롭다고 하더라구요..... 또 무조건 Template sequence의 중간부분을 설정해서 겹치게 primer를 짜는게 아니라.... self dimer 와 primer pair dimer, hair pin 등을 고려해서 primer를 짜야하기 때문에 이것도 짜는게 그리 수월치는 않다고 하더군요.... design이 잘못되었을 경우에는 좌~악 끌리거나..... 사다리처럼 연속적인 band가 생기가도 하구요.... 너무 심할 경우에는 annealing 온도조절만으로 되질 않기도 하거든요..... 일반적인 클로닝용 primer와 달리 primer의 길이가 거진 2배 이상이기 때문에 GC배열 위치에 따라서도 결과가 달라질 수 있다고 합니다. 또한가지는 Template를 만들고 나서 염기서열을 분석했을 때에 합성과정에서 나타나는 염기서열의 오류를 고려하셔야 합니다. 합성과정에서 염기가 잘못들어가서 몇개 염기가 치환되어버리는 일이 가끔 벌어집니다. 그래서 이러한 때에는 일반적인 Taq은 사용하지 않구요.... iMaxII(intron) 나 Ex-taq(TAKARA) 같은 것을 사용하는데... 그래도 조금은 생긴다더군요.... 그냥 Taq사용하는 것 보다는 좋지많요..... * iMaxII는 인트론에서 나온건데.... TAKARA EX-Taq하구 같은거라고 하는것을 들어본적이 있어요.... 그래서 EX-Taq대신에 사용한 적도 있어요 >35mer primer 14개를 사용해서 400bp 정도의 gene을 합성 하려고 합니다.. >그런데.. 생각보다 쉽지는 않네요... 어디에서 문제가 있느건지...--; >gene synthesis를 할때 중요한 점 좀 가르쳐주세요... >아님 잘 나와 있는 논문이라도... >사용하시는 프로토콜을 가르쳐주시면 더욱 좋구요...^^ > >그리고 primer를 mixing 할때 30uM을 각각 넣으라고 하는데요... 100pmol primer를 얼마나 넣어야 39uM이 되는건가요? primer는 어떻게 농도를 계산하는지 모르겠습니다.. > >도와주세요... > -
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박현님의 답변
2008-01-11- 0
우선 primer의 길이가 좀 긴거 같네요.. 그래도 PCR시 이용하는 annealing 온도만 잘 맞춰주면 나올 수 있을거예요.. 원하시는 band가 안 나온거라면 우선 annealing 온도를 낮춰보세요.. 그리고 가능하다면 여러 온도에서 수행한 후 조건을 잡는게 가장 좋은 방법 일거 같네요~~ >35mer primer 14개를 사용해서 400bp 정도의 gene을 합성 하려고 합니다.. >그런데.. 생각보다 쉽지는 않네요... 어디에서 문제가 있느건지...--; >gene synthesis를 할때 중요한 점 좀 가르쳐주세요... >아님 잘 나와 있는 논문이라도... >사용하시는 프로토콜을 가르쳐주시면 더욱 좋구요...^^ > >그리고 primer를 mixing 할때 30uM을 각각 넣으라고 하는데요... 100pmol primer를 얼마나 넣어야 39uM이 되는건가요? primer는 어떻게 농도를 계산하는지 모르겠습니다.. > >도와주세요... >