2008-01-24
org.kosen.entty.User@1a2c18e
박선영(pgene)
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안녕하세요..질문좀...
western blot에 사용할 1차 항체를 만들어야 하는데요,
1차 항체량이(모노크로날 항체의 단백질량을 바탕으로) 10.6mg/ml인데 이것을 농도 1.5마이크로리터/ml가 되도록 항체 희석용 완충용액에서 희석하여 혼합하라고 되어 있습니다. e.p 튜브에 1차 항체가 담아아져왔던데 이것을 어떻게 해야 위 말대로 제조할 수 있을까요?
계산방법과 제조 방법좀..알려주세요.
아주아주 급합니다.
부탁드려요~
- western
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답변 3
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답변
장성재님의 답변
2008-01-24- 0
>western blot에 사용할 1차 항체를 만들어야 하는데요, --> 항체를 blocking buffer에 희석한다는 말씀이시군요. >1차 항체량이(모노크로날 항체의 단백질량을 바탕으로) 10.6mg/ml인데 이것을 농도 1.5마이크로리터/ml가 되도록 항체 희석용 완충용액에서 희석하여 혼합하라고 되어 있습니다. e.p 튜브에 1차 항체가 담아아져왔던데 이것을 어떻게 해야 위 말대로 제조할 수 있을까요? --> 간단히 blocking buffer 1mL당 항체 원액 1.5 uL를 섞어주시면 됩니다. (엄밀히 말하면 항체 1.5uL + blocking buffer 0.9985mL) -
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박선영님의 답변
2008-01-24- 0
'간단히 blocking buffer 1mL당 항체 원액 1.5 uL를 섞어주시면 됩니다. (엄밀히 말하면 항체 1.5uL + blocking buffer 0.9985mL)' 이렇게 하라고 하셨는데요.. blocking buffer가 TTBS와 젤라틴으로 조제된 buffer를 말씀하시는거 맞나요? 제가 가지고 있는 설명서에는 위처럼 제조된 buffer에 희석해서 사용하라고 했는데.. 1차 항체는 5ul정도 있는거 같구요... 그럼 양이 너무 적은거 아닌가요? 밤새 1차 항체에 담궈둬야 하는데...5ml이면 너무 적잖아요... 방법을...그리고 얼려있는데 녹이면 되는건가요? 부탁드려요. -
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장성재님의 답변
2008-01-24- 0
>blocking buffer가 TTBS와 젤라틴으로 조제된 buffer를 말씀하시는거 맞나요? 제가 가지고 있는 설명서에는 위처럼 제조된 buffer에 희석해서 사용하라고 했는데.. 1차 항체는 5ul정도 있는거 같구요... 그럼 양이 너무 적은거 아닌가요? 밤새 1차 항체에 담궈둬야 하는데...5ml이면 너무 적잖아요... 방법을...그리고 얼려있는데 녹이면 되는건가요? 부탁드려요. --> western blotting이 처음이신가요? 교과서를 세심히 검토하신 후 실험에 임하시길 바랍니다. 주위의 경험있는 선배나 교수님께 직접 여쭈어보시는 것도 좋겠구요. blocking buffer는 TTBS와 젤라틴으로 조제된 buffer를 의미합니다. 항체 원액의 농도가 10.6mg/mL이므로 희석 후 농도도 약 16ug/mL으로 적은 농도는 아닙니다. blotting된 막의 면적에 따라서 차이는 있지만 hybridization용 bag 등을 사용하시면 1-2mL 정도의 volume으로도 충분히 1차 항체의 반응이 가능합니다. 더군다나 반응성에 따라서 차이가 있을 수 있습니다만 monoclonal antibody의 경우에는 위에 언급한 농도 이하에서도 충분히 반응이 가능하므로 희석된 항체의 volume을 2배 이상 늘릴 수도 있습니다. 얼려있는 상태의 항체원액은 물론 녹이신 후 사용하시는 것이죠. 단 freeze-thawing을 반복하시는 것은 항체의 역가를 떨어뜨리는 원인이 됩니다.