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지식나눔

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urea등이 녹여있는 단백질 샘플의 전기영동시...

2008-01-28 org.kosen.entty.User@2fed6dde 오상남(aramice7)
  • 1
western을 하려고 urea, chaps, DTT등이 녹여 있는 샘플을 SDS-PAGE를 했습니다. 결과가 영 엉망이더군요. 전기영동 패턴은 곧 잘나오는데, 웨스턴 밴드가 막 구불거리고 암튼 정량하기 힘들 정도 였어요. 로딩시 그냥 일반 샘플 버퍼(SDS, mercaptoethaol, glycerol, BPB포함)를 넣고 끓이지는 않았습니다. urea때문에.. 이런 경험있으신 분 있으면 조언부탁드립니다.
  • SDS-PAGE
  • western
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답변 1
  • 답변

    박재봉님의 답변

    2008-02-12
    • 0
    >western을 하려고 urea, chaps, DTT등이 녹여 있는 샘플을 SDS-PAGE를 했습니다. 결과가 영 엉망이더군요. 전기영동 패턴은 곧 잘나오는데, 웨스턴 밴드가 막 구불거리고 암튼 정량하기 힘들 정도 였어요. >로딩시 그냥 일반 샘플 버퍼(SDS, mercaptoethaol, glycerol, BPB포함)를 넣고 끓이지는 않았습니다. urea때문에.. >이런 경험있으신 분 있으면 조언부탁드립니다. 전기영동상의 문제라고 생각됩니다. 왜냐하면 밴드가 구부러져 나오니까요. 1) SDS-PAGE 시료에 detergent가 있으면 아마 micelle을 형성하는지 전기영동이 잘 안되더라구요. 아마SDS와 detergent가 결합하여 단백질에 결합하는 게 부족한 듯합니다. Detergent를 제거하고 전기영동을 하셔야 할 것 같습니다. 2) Urea같은 solite가 많아도 전기 영동이 안되더군요. 특히 NaCl 같은 이온들이 많으면 밴드가 퍼지고 전극으로 전하가 대신 끌려가는 것 같습니다. 번거로우시더라도 centricone등으로 시료를 농축하고 다시 완충액이나 DW로 희석하여 농축한 후 sample buffer를 넣고 끓이시는 게 좋을 듯 합니다.
    답변수정
    >western을 하려고 urea, chaps, DTT등이 녹여 있는 샘플을 SDS-PAGE를 했습니다. 결과가 영 엉망이더군요. 전기영동 패턴은 곧 잘나오는데, 웨스턴 밴드가 막 구불거리고 암튼 정량하기 힘들 정도 였어요. >로딩시 그냥 일반 샘플 버퍼(SDS, mercaptoethaol, glycerol, BPB포함)를 넣고 끓이지는 않았습니다. urea때문에.. >이런 경험있으신 분 있으면 조언부탁드립니다. 전기영동상의 문제라고 생각됩니다. 왜냐하면 밴드가 구부러져 나오니까요. 1) SDS-PAGE 시료에 detergent가 있으면 아마 micelle을 형성하는지 전기영동이 잘 안되더라구요. 아마SDS와 detergent가 결합하여 단백질에 결합하는 게 부족한 듯합니다. Detergent를 제거하고 전기영동을 하셔야 할 것 같습니다. 2) Urea같은 solite가 많아도 전기 영동이 안되더군요. 특히 NaCl 같은 이온들이 많으면 밴드가 퍼지고 전극으로 전하가 대신 끌려가는 것 같습니다. 번거로우시더라도 centricone등으로 시료를 농축하고 다시 완충액이나 DW로 희석하여 농축한 후 sample buffer를 넣고 끓이시는 게 좋을 듯 합니다.
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