2008-02-13
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이선민(danji2026)
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필름을 감광할때 전기영동, 트랜스퍼 까지 아무 문제 없이 했습니다. 트랜스퍼 끝나고 폰슈로 확인했을때도 단백질이 보였습니다. 그런데 1차 안티바디와 2차를 처리하고 필름에 감광을 하면 아무 밴드도 나타나지 않고 조금있음 필름이 타버립니다. 빛이 없는 암실에서 하는 데도 그렇고 오래 감광하지도 않았습니다. 그리고 2차 안티바디도 새로 사서 바꿔서 사용하였습니다 도대체 무엇이 문제일까요 2달 동안 계속 결과가 나오지 않아서 속상합니다.
- western blot
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답변 5
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답변
장병기님의 답변
2008-02-13- 0
1. 필름은 상태 양호 한가요? 현상액에 필름 일부를 미리 적셔서 확인해 보세요. 빛에 노출된 필름은 금방 까맣게 변합니다. 당연히 사용 못하겠죠. 필름이 양호하다면 현상액을 더 희석해서 사용해보세요. 기존의 것이 5X 짜리면 7-10X 정도로... 물론 다른 항체를 이용한 현상에 문제가 없다면 이것도 답은 아닐 겁니다. 2. 다른 항체를 이용하였을 때 결과는 잘 나오나요? 잘 나온다면 지금 사용하시는 1차 항체가 잘 안되는 것일수 있습니다. 3. 1차 항체가 poly 인가요? 그러면 3-5% skim-milk 버퍼에 항체를 녹여 사용해 보세요. 1차 항체 붙히고 나서 2차 항체 붙히기 전에 5분*3번 정도 washing 해 주세요. 4. 폰슈를 이용하지 마시고 염색된 protein marker 를 이용하세요. trnasfer 확인은 이것으로도 확인되니까요. 5. 혹 2차 항체를 실수로 잘 못 사용하고 계신건 아니신가요? 가끔 실험하다보면 실수하는 거라서... 알면서도 잘 못 쓸때도 있으니까요. 6. washing 은 2시간 정도 해도 무방합니다. 혹 washing 시간이 적은 건 아닌가요. 2달동안 밴드도 못 보시고 답답하시겠습니다. 밴드 나와도 원하는 결과 나온다는 보장도 없을 텐데... 그럼 일반적인 답변이었습니다. >필름을 감광할때 전기영동, 트랜스퍼 까지 아무 문제 없이 했습니다. 트랜스퍼 끝나고 폰슈로 확인했을때도 단백질이 보였습니다. 그런데 1차 안티바디와 2차를 처리하고 필름에 감광을 하면 아무 밴드도 나타나지 않고 조금있음 필름이 타버립니다. 빛이 없는 암실에서 하는 데도 그렇고 오래 감광하지도 않았습니다. 그리고 2차 안티바디도 새로 사서 바꿔서 사용하였습니다 도대체 무엇이 문제일까요 2달 동안 계속 결과가 나오지 않아서 속상합니다. > -
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이선민님의 답변
2008-02-14- 0
>필름을 감광할때 전기영동, 트랜스퍼 까지 아무 문제 없이 했습니다. 트랜스퍼 끝나고 폰슈로 확인했을때도 단백질이 보였습니다. 그런데 1차 안티바디와 2차를 처리하고 필름에 감광을 하면 아무 밴드도 나타나지 않고 조금있음 필름이 타버립니다. 빛이 없는 암실에서 하는 데도 그렇고 오래 감광하지도 않았습니다. 그리고 2차 안티바디도 새로 사서 바꿔서 사용하였습니다 도대체 무엇이 문제일까요 2달 동안 계속 결과가 나오지 않아서 속상합니다. >2달 전에는 깨끗이 필름도 잘 나오고 밴드도 잘 나왔능데 갑자기 안나오니 필름도 바꾸어 보았고 2차 안티바디도 계속 써왔던 거라 문제는 없습니다.ㅠㅠ -
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장병기님의 답변
2008-02-14- 0
1차 항체가 무엇인지 알수 있을까요? 버퍼도 바꾸어 사용해 보셨나요? 저의 경험상 TBS pH 7.4 쓰면 가끔 지저분하게 나오더라구요. 그래서 TBS 만들때 pH 조정 안해주고 쓰고요 (대략 pH 11-12정도 나올겁니다). 전 TBS 보다는 PBS 를 많이 사용합니다. PBS pH 7.4... PBS 야 만들면 pH 가 대충 7 근방이 되서 따로 맞춰서 쓰지는 않지만...(웨스턴용으로) 웨스턴이 안 될시에는 하나씩 바꾸지 마시고 고생되더라도 전부 다 바꿔서 하는게 낫습니다. 거의 없겠지만 간혹 시약이 오염되어 실험이 잘 못될 경우도 있습니다. 웨스턴 테스트만 할라해도 이틀인데... 수고하세요~ >訶㎱?감광할때 전기영동, 트랜스퍼 까지 아무 문제 없이 했습니다. 트랜스퍼 끝나고 폰슈로 확인했을때도 단백질이 보였습니다. 그런데 1차 안티바디와 2차를 처리하고 필름에 감광을 하면 아무 밴드도 나타나지 않고 조금있음 필름이 타버립니다. 빛이 없는 암실에서 하는 데도 그렇고 오래 감광하지도 않았습니다. 그리고 2차 안티바디도 새로 사서 바꿔서 사용하였습니다 도대체 무엇이 문제일까요 2달 동안 계속 결과가 나오지 않아서 속상합니다. > -
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이유진님의 답변
2008-02-15- 0
>필름을 감광할때 전기영동, 트랜스퍼 까지 아무 문제 없이 했습니다. 트랜스퍼 끝나고 폰슈로 확인했을때도 단백질이 보였습니다. 그런데 1차 안티바디와 2차를 처리하고 필름에 감광을 하면 아무 밴드도 나타나지 않고 조금있음 필름이 타버립니다. 빛이 없는 암실에서 하는 데도 그렇고 오래 감광하지도 않았습니다. 그리고 2차 안티바디도 새로 사서 바꿔서 사용하였습니다 도대체 무엇이 문제일까요 2달 동안 계속 결과가 나오지 않아서 속상합니다. > 다른분들이 말씀을 다 하셔서 저는 보충만 하겠습니다. 2차 안티바디까지 붙여 washing후 마지막에 detection solution(제경우 ECL plus western blotting detection reagent를 사용했습니다)을 새것으로 해보던가, 암실에서 작업을 해보심이 어떠신지요? 저도 아예 안나오던 것이 Detection solution을 바꿔보니 나오는 경우도 있었습니다. -
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김재규님의 답변
2008-02-20- 0
>필름을 감광할때 전기영동, 트랜스퍼 까지 아무 문제 없이 했습니다. 트랜스퍼 끝나고 폰슈로 확인했을때도 단백질이 보였습니다. 그런데 1차 안티바디와 2차를 처리하고 필름에 감광을 하면 아무 밴드도 나타나지 않고 조금있음 필름이 타버립니다. 빛이 없는 암실에서 하는 데도 그렇고 오래 감광하지도 않았습니다. 그리고 2차 안티바디도 새로 사서 바꿔서 사용하였습니다 도대체 무엇이 문제일까요 2달 동안 계속 결과가 나오지 않아서 속상합니다. > 나오다가 갑자기 안나오면 미치죠.. 저도 비슷한 경험을 했습니다. 이유는 생각보다 간단한데 있습니다. 멤브레인이 트랜스퍼될때 용액이 러닝버퍼와 조금만 섞이거나 스킨밀크 같은것과 먼저 닿으면 트랜스퍼는 되지만 밴드는 나타나지 않습니다. 새로 버퍼를 만드시고 멤브레인이 트랜스퍼 버퍼에 적셔질？？를 유심히 관찰해보시길.. 버퍼에서 마르는 속도가 너무 느리면 이상한겁니다. 아니면 아에 안마르기도 합니다. 필름이 타는이유는 과도한 ECL용액을 처리한것으로 생각됩니다. 아님 2차 처리후 세척을 너무 적게 한경우입니다. 그럼 부디 좋은 결과 얻으시길..^^