2008-02-27
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전정민(wjdals98)
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제가 pRTKL2라는 유산균 벡터와 제가 클로닝한 insert를 이용해서 E.coli DH5 알파를 이용해서 클로닝을 하려고 합니다.
pRTKL2는 Erm+ 내성을 갖고 있고, LacZ가 들어있어 EcoRI으로 자르고, 제가 클로닝한 insert 유전자도 마찬가지로 EcoRI으로 자른 후 heat shock을 이용해 transformation 하고 있습니다.
여기서 문제입니다..
x-gal 과 IPTG를 이용해서 Erythromycin이 깔린 LB 배지에 도말 한 후 white colony를 배양하여 plasmid prep하고 enzyme으로 다시 확인해보면 제대로 ligation이 안되서 그런지 벡터끼리 붙어서 self-ligation이 잘 되고, insert가 잘 안들어갑니다. 참고로 유산균 벡터 크기는 약 6.5kb 정도 이고, insert는 1.2kb 입니다. EcoRI enzyme 으로 잘라서 확인하면 벡터크기만 나옵니다.
또 한가지는 유산균 벡터의 erm+ 농도가 100ug/ml 인데, Erm+ 100ug/ml 이 들어있는 항생제 배지에 ligation mixture와 DH5 알파로 만든 competant cell을 섞은 후 도말해서 담날 콜로니를 확인하려고 하면 왜 배지에 셀이 쫙 깔리는지 이해가 안됩니다. 콜로니상태가 아닌.. 그래서 항생제를 다시 만들어서 배지도 새로 만들어보고, 균도 확인해보고, 그랬는데도 셀이 쫙 깔린다는게 이해가 안됩니다.
두번째 이유 경우에..셀이 깔리는 이유가 혹시...transformation 시 cell 양이 많거나 아니면 ligation 할때 벡터끼리 self가 되는 경우가 너무 많아서 오히려 셀이 깔려서 자랄수도 있지 않나 해서요...
제 생각에는 벡터양을 희석하고, insert 농도는 높게 하면 self-ligation 을 어느정도 막을 수 있지 않나요? 어찌해야할지 난감하네요..
두가지 문제때문에 클로닝이 전혀 안되고 있습니다.
끝가지 읽어주셔서 감사합니다..조언좀 해주세요..ㅠ.ㅠ
- ligation
- trasformation
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답변 1
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답변
박현님의 답변
2008-02-28- 0
첫 번째 문제로 vector의 self ligation이라고 했는데.. 그럼 self ligation을 방지하기 위해 alkaline phosphatase를 이용해 보세요.. vector를 enzyme으로 cutting한 다음에 alkaline phosphatase를 처리한 다음에 정제하여 ligation을 하시면 self ligation을 방지 하실 수 있을 겁니다. 아니면 ligation시 insert의 양을 늘려서 한번 해보세요... 그리고 두 번째 문제로 transformation후 colony가 많이 생긴다고 하셨는데요.. 그건 heat shock을 하고 나서 세포를 도말하실때 세포를 희석해서 까시면 될거 같은데요.. 솔직히 competent cell의 양을 줄이는 것은 좋은 방법은 아닌것 같습니다. 조금이라도 도움이 되었음 좋겠네요.. 수고하시고요.. 실험 열심히 하세요~~