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지식나눔

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단백질 분해 효소 활성 측정

2008-04-08 org.kosen.entty.User@432422f5
  • 2
단백질 분해 효소 활성 측정 방법을 알고 싶어서 문의 드립니다. 아무리 검색하고 찾아봐도 저희에게 맞는 방법이 없어서요... 저희는 양어용 사료에 단백질분해효소를 첨가하여 pH 5~6 상태에서 단백질분해가 활발히 이루어지 는지 알고 싶습니다. 카제인을 가지고 하는 실험은 해본 상태구요, 다른 방법도 알고 싶습니다 성실합 답변 부탁드릴께요~
  • protease
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답변 2
  • 답변

    이상후님의 답변

    2008-04-08
    • 0
    최근에 “Nature Protocols“에 나온 방법을 소개해 드립니다. 이 방법은 Azo dye-impregnated collagen인 Azocoll(Sigma에서 구입 가능)을 이용해서 protease activity assay에 대한 chromogenic non-specific substrate로서 사용하게 됩니다. Proteolysis가 일어날 경우에는 azo dye-impregnation으로 자주색을 갖는 soluble fragments가 만들어지고 이것이 550nm에서 흡광도로 검출되게 됩니다. 자세한 방법은 아래를 참고하세요. 1. Resuspend 75 mg of Azocoll with 50 ml of 0.01 M PBS, pH 7.4. 2. Gently swirl the suspension at room temperature for 2 h. 3. Centrifuge the mixture at 10,000 x g at room temperature for 10 min. 4. Remove the supernatant containing the degraded peptide which may cause high background in protease activity assay. 5. Repeat steps 1 to 4. 6. Resuspend the washed Azocoll reagent in 50 ml of 0.01 M PBS, pH 7.4. This is ready for further protease activity assay. 7. For protease activity assay, incubate 100 μl of the protease under examination with 400 μl of the Azocoll reagents from step 6, under gentle end-to-end rotation at room temperature for 2 h. Set up triplicates for each sample. 8. Centrifuge the reaction mixture at 10,000 x g at room temperature for 10 min. 9. Transfer the supernatant to a 96 well microtitre plate. 10. Monitor the absorbance at 550 nm using ELISA reader. 11. The protease activity is presented as the A550 of the incubation supernatant.
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    최근에 “Nature Protocols“에 나온 방법을 소개해 드립니다. 이 방법은 Azo dye-impregnated collagen인 Azocoll(Sigma에서 구입 가능)을 이용해서 protease activity assay에 대한 chromogenic non-specific substrate로서 사용하게 됩니다. Proteolysis가 일어날 경우에는 azo dye-impregnation으로 자주색을 갖는 soluble fragments가 만들어지고 이것이 550nm에서 흡광도로 검출되게 됩니다. 자세한 방법은 아래를 참고하세요. 1. Resuspend 75 mg of Azocoll with 50 ml of 0.01 M PBS, pH 7.4. 2. Gently swirl the suspension at room temperature for 2 h. 3. Centrifuge the mixture at 10,000 x g at room temperature for 10 min. 4. Remove the supernatant containing the degraded peptide which may cause high background in protease activity assay. 5. Repeat steps 1 to 4. 6. Resuspend the washed Azocoll reagent in 50 ml of 0.01 M PBS, pH 7.4. This is ready for further protease activity assay. 7. For protease activity assay, incubate 100 μl of the protease under examination with 400 μl of the Azocoll reagents from step 6, under gentle end-to-end rotation at room temperature for 2 h. Set up triplicates for each sample. 8. Centrifuge the reaction mixture at 10,000 x g at room temperature for 10 min. 9. Transfer the supernatant to a 96 well microtitre plate. 10. Monitor the absorbance at 550 nm using ELISA reader. 11. The protease activity is presented as the A550 of the incubation supernatant.
    등록된 댓글이 없습니다.
  • 답변

    안길홍님의 답변

    2010-01-27
    • 0

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    >단백질 분해 효소 활성 측정 방법을 알고 싶어서 문의 드립니다. >>아무리 검색하고 찾아봐도 저희에게 맞는 방법이 없어서요...>>저희는 양어용 사료에 단백질분해효소를 첨가하여 pH 5~6 상태에서 단백질분해가 활발히 이루어지>>는지 알고 싶습니다. 카제인을 가지고 하는 실험은 해본 상태구요, 다른 방법도 알고 싶습니다>>성실합 답변 부탁드릴께요~ 첨부자료
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    >단백질 분해 효소 활성 측정 방법을 알고 싶어서 문의 드립니다. >>아무리 검색하고 찾아봐도 저희에게 맞는 방법이 없어서요...>>저희는 양어용 사료에 단백질분해효소를 첨가하여 pH 5~6 상태에서 단백질분해가 활발히 이루어지>>는지 알고 싶습니다. 카제인을 가지고 하는 실험은 해본 상태구요, 다른 방법도 알고 싶습니다>>성실합 답변 부탁드릴께요~ 첨부자료
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