2008-04-29
org.kosen.entty.User@29d9d170
이지연(elfinee)
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실험을 하다보면, 프로토콜에 따라서 하기만 하고 왜 그런지 잘 모르는 경우가 있는데, immunostaining에 대해서도 비슷한 의문이 하나 있습니다.
Immunostaining을 할 때에 왜 1st antibody와 2ndary antibody를 나누어서 처리하는가 하는 것입니다. 보통 프로토콜들에서는 fluorophore가 labeled된 1st antibody 한가지를 쓰는게 아니라 특정 단백질에 특이적인 antibody를 먼저 쓰고 species에 특이적인 antibody를 쓰는데 이렇게 하는 것이 단순히 비용문제인지 아니면 그러한 방법이 좀더 robust해서 쓰는 것인지 궁금합니다.
전에 비슷한 질문을 아는 사람에게 한것 같은데, 아마도 그 이유가 conjugation하면서 antibody의 손실이 생기기 때문에 안그래도 비싼 antibody에 형광을 붙이는것 보다는 2ndary antibody를 사용하는게 좋고, 2ndary antibody 한가지만 가지고도 어러 primary antibody에 대해서 쓸 수 있다는 얘기로 기억합니다.
이 말이 맞는 말인가요? 그렇다면 primary antibody로 labeled된 antibody를 구입할 수 있으면 그 antibody를 사용하는 것이 더 나을까요?
두 번째 질문은 autolfuorescence에 대한 것입니다.
저는 hepatocytes를 glass slide에서 배양해서 immunostaining을 하는데 rat primary hepatocytes나 HepG2 세포들을 사용하고 있습니다. 그런데 4% PFA를 사용해서 fixation을 하면 autofluorescence가 관찰되곤 합니다. 그래서 다른 fixation 방법들을 사용해 보기도 하고 sodium borohydride도 사용해봤지만 그다지 만족스럽지는 않았습니다.
Acetone을 사용한 것이 그나마 괜찮았던것 같은데 acetone이 fixation하는 원리는 ethanol로 단백질 침전시키는 것과 같은 원리인가요? 이런 fixative로 처리하면 실제로 보고자 하는 단백질들에 나쁜영향을 끼치지는 않나요?
더불어 autofluorescence에 대한 조언이 있으시면 부탁드립니다.
경험 많으신 분들의 도움을 부탁드립니다.
감사합니다.
- Immunostaining
- autofluorescence
- fixation
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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