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western blot 실험 중 샘플 boiling과 냉각의 이유

2008-05-06 org.kosen.entty.User@5f3ddae8 전혜영(jean0407)
  • 2
western blot 실험 중 샘플 boiling을 하고 다시 냉각 시키는 이유가 뭔가요; 또한 blacking을 왜 해주는 거예요?
  • western blot
  • boiling
  • blacking
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답변 2
  • 답변

    서기원님의 답변

    2008-05-06
    • 0
    > > > western blot 실험 중 샘플 boiling을 하고 > 다시 냉각 시키는 이유가 뭔가요; > > 또한 blacking을 왜 해주는 거예요? > > 조회수는 많은데.. 답변이 없어서.. 확실하진 않치만.. 참고하시라고.. DNA 혹은 단백실 실험에서.. denaturation 과 renaturation 에 대해서 배우셨을껍니다.. 열을 가해주면.. 변성이 일어나고 온도를 낮추면 다시 원상태로 돌아오죠.. 이러한 변화중 중간 상태로 있게 하는 온도를 보통 TM이라고 하고... 이러한 반응은 일반적으로 적당한 시간이 주어진 상태에서 가능합니다. 자신에 맞는 상보 염기쌍을 찾아가 zipping 될 시간이나 folding 되는 시간 즉 renaturation에 필요한 시간역시 필요하다는 의미입니다.. 하지만, 급속히 온도를 떨어뜨리면 이러한 renaturation 비율이 크게 떨어지게 됩니다... 그럼 본론으로 page 할때.. 샘플을 buffer. 와 넣고 끓이면 단백질 변성이 일어나고. 이것을 SDS가 둘러쌈으로써 nagative charge를 주는것과 동시에 변성 상태를 유지하게 합니다.. 샘플을 끊인후 서서히 식히면 위에서 제가 말한 이유로 해서 renaturation이 좀더 잘 일어나겠죠?? 따라서 좀더 변성 상태를 많이 유지하게끔 빠른 시간에 급속히 식히는 것으로 알고 있습니다... 전적으로 확실한것은 아님니다.. 예전에 처음 실험 배울때 선배한테인가. 책에서인가 본기억으로 말씀드린 겁니다.. 그리고 둘째로 blocking하는 이유는 단백질을 membrane에 transfer 하고 나서 blocking을 하게 되는데 만약!! 하지 않게 되면 1차 항체를 붙일때 1차 항체가 내 단백질 뿐이니라membrane에도 달라 붙게 됨니다... 항체도 단백질이니까요... 즉 내가 transfer한 단백질이 붙어있는 부위를 제외한 나머지 부위를 비특이적 단백질로 채워서 항체가 내가 transfer한 단백질과만 반응할 기회를 주고 membrane에는 붙지 못하게 하기 위해서 입니다. blocking을 하지 않게 된다면.. 나중에 발색했을때.. background 염색이 심하여 결과를 얻을수 없습니다.. 실험 잘하시고 좋은 결과 얻으세요..ㅣ
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    > > > western blot 실험 중 샘플 boiling을 하고 > 다시 냉각 시키는 이유가 뭔가요; > > 또한 blacking을 왜 해주는 거예요? > > 조회수는 많은데.. 답변이 없어서.. 확실하진 않치만.. 참고하시라고.. DNA 혹은 단백실 실험에서.. denaturation 과 renaturation 에 대해서 배우셨을껍니다.. 열을 가해주면.. 변성이 일어나고 온도를 낮추면 다시 원상태로 돌아오죠.. 이러한 변화중 중간 상태로 있게 하는 온도를 보통 TM이라고 하고... 이러한 반응은 일반적으로 적당한 시간이 주어진 상태에서 가능합니다. 자신에 맞는 상보 염기쌍을 찾아가 zipping 될 시간이나 folding 되는 시간 즉 renaturation에 필요한 시간역시 필요하다는 의미입니다.. 하지만, 급속히 온도를 떨어뜨리면 이러한 renaturation 비율이 크게 떨어지게 됩니다... 그럼 본론으로 page 할때.. 샘플을 buffer. 와 넣고 끓이면 단백질 변성이 일어나고. 이것을 SDS가 둘러쌈으로써 nagative charge를 주는것과 동시에 변성 상태를 유지하게 합니다.. 샘플을 끊인후 서서히 식히면 위에서 제가 말한 이유로 해서 renaturation이 좀더 잘 일어나겠죠?? 따라서 좀더 변성 상태를 많이 유지하게끔 빠른 시간에 급속히 식히는 것으로 알고 있습니다... 전적으로 확실한것은 아님니다.. 예전에 처음 실험 배울때 선배한테인가. 책에서인가 본기억으로 말씀드린 겁니다.. 그리고 둘째로 blocking하는 이유는 단백질을 membrane에 transfer 하고 나서 blocking을 하게 되는데 만약!! 하지 않게 되면 1차 항체를 붙일때 1차 항체가 내 단백질 뿐이니라membrane에도 달라 붙게 됨니다... 항체도 단백질이니까요... 즉 내가 transfer한 단백질이 붙어있는 부위를 제외한 나머지 부위를 비특이적 단백질로 채워서 항체가 내가 transfer한 단백질과만 반응할 기회를 주고 membrane에는 붙지 못하게 하기 위해서 입니다. blocking을 하지 않게 된다면.. 나중에 발색했을때.. background 염색이 심하여 결과를 얻을수 없습니다.. 실험 잘하시고 좋은 결과 얻으세요..ㅣ
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  • 답변

    전현주님의 답변

    2008-05-06
    • 0
    Western blot하기 전에 거는 gel에SDS가 들어가지요? 그럼 그건 SDS-PAGE입니다. SDS-PAGE는 단백질의 2차구조나 그런 것들의 영향을 모두 배제하고 오로지 분자량만으로 단백질을 분리하고자 할 때 이용하는 gel입니다. SDS에 의하여 단백질에 있는 charge들이 거의 다 음성을 띠게 되기 때문에 단백질의 2차 구조는 일단 다 파괴된다고 보면 됩니다. 그런데 단백질 이차 구조를 유지하는 중요한 결합이 S-S 결합이 SDS 첨가만으로는 잘 파괴되지 않습니다. 그래서 beta-mercaptoethanol (loading buffer의 성분 중 하나)을 넣고 열을 가해주게 되면 이 결합이 -SH SH-로 끊어지게 됩니다. 그래서 가열을 해주는 것이고, 그러니까 loading buffer를 넣고 가열해야겠지요. 가열 후 얼리는 것은 단백질을 변성없이 보관을 위한 것이고 단백질 denaturation과는 상관이 없습니다. 그러니까 냉동하지 않고 끓인 후 바로 gel에 loading하셔도 됩니다. 바로 실험할 준비가 되어 있으면 그렇게 하는 것이 좋겠지요. 다만, 경우에 따라, 핵 안에 존재하는 단백질이나, 염색체 구조를 이루고 있는 단백질의 경우 세포 pellet을 -70C나 액체 질소에 몇번 얼렸다 녹였다 하면서 그 온도 차이로 세포를 깨는 경우도 있지만, 이건 단백질 샘플을 끓인후 얼리는 것과는 경우가 다르지요. Blocking의 이유는 윗분의 설명이 충분하다고 생각합니다. 좀처 affinity가 높은 단백질-항체 결합만 남기겠다는 말이지요. 그럼.... > > > western blot 실험 중 샘플 boiling을 하고 > 다시 냉각 시키는 이유가 뭔가요; > > 또한 blacking을 왜 해주는 거예요? > >
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    Western blot하기 전에 거는 gel에SDS가 들어가지요? 그럼 그건 SDS-PAGE입니다. SDS-PAGE는 단백질의 2차구조나 그런 것들의 영향을 모두 배제하고 오로지 분자량만으로 단백질을 분리하고자 할 때 이용하는 gel입니다. SDS에 의하여 단백질에 있는 charge들이 거의 다 음성을 띠게 되기 때문에 단백질의 2차 구조는 일단 다 파괴된다고 보면 됩니다. 그런데 단백질 이차 구조를 유지하는 중요한 결합이 S-S 결합이 SDS 첨가만으로는 잘 파괴되지 않습니다. 그래서 beta-mercaptoethanol (loading buffer의 성분 중 하나)을 넣고 열을 가해주게 되면 이 결합이 -SH SH-로 끊어지게 됩니다. 그래서 가열을 해주는 것이고, 그러니까 loading buffer를 넣고 가열해야겠지요. 가열 후 얼리는 것은 단백질을 변성없이 보관을 위한 것이고 단백질 denaturation과는 상관이 없습니다. 그러니까 냉동하지 않고 끓인 후 바로 gel에 loading하셔도 됩니다. 바로 실험할 준비가 되어 있으면 그렇게 하는 것이 좋겠지요. 다만, 경우에 따라, 핵 안에 존재하는 단백질이나, 염색체 구조를 이루고 있는 단백질의 경우 세포 pellet을 -70C나 액체 질소에 몇번 얼렸다 녹였다 하면서 그 온도 차이로 세포를 깨는 경우도 있지만, 이건 단백질 샘플을 끓인후 얼리는 것과는 경우가 다르지요. Blocking의 이유는 윗분의 설명이 충분하다고 생각합니다. 좀처 affinity가 높은 단백질-항체 결합만 남기겠다는 말이지요. 그럼.... > > > western blot 실험 중 샘플 boiling을 하고 > 다시 냉각 시키는 이유가 뭔가요; > > 또한 blacking을 왜 해주는 거예요? > >
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