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지식나눔

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flow cytometry결과에 대한 질문입니다

2008-05-08 org.kosen.entty.User@3ff30b63 이선민(danji2026)
  • 2

첨부파일

제가 암세포에 물질을 처리하여 PI염색을 하여 flow cytometry를 측정한것인데..결과가 다음과 같이 나왔습니다. 이것을 이렇게 해석을 해도 되는지 의문이 되어서요 농도가 증가할수록 sub G1기의 양이 늘어나는 것으로 보아 세포가 많이 사멸했다고 해석을 할 수 있는지요??
  • flow cytometry
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답변 2
  • 답변

    윤진선님의 답변

    2008-05-09
    • 0
    >제가 암세포에 물질을 처리하여 PI염색을 하여 flow cytometry를 측정한것인데..결과가 다음과 같이 나왔습니다. 이것을 이렇게 해석을 해도 되는지 의문이 되어서요 농도가 증가할수록 sub G1기의 양이 늘어나는 것으로 보아 세포가 많이 사멸했다고 해석을 할 수 있는지요?? > 네, 세포가 죽기때문에 cell cycle에서 볼 수 있는 G1,S, G2/M의 피크가 사라진 거구요... 만약 apoptosis를 보구 싶으시다면, PI, Annexin V doulbe staining을 해보시면 더 확실히 아실 수 있으실 겁니다. necrosis인지 apoptosis인지..
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    >제가 암세포에 물질을 처리하여 PI염색을 하여 flow cytometry를 측정한것인데..결과가 다음과 같이 나왔습니다. 이것을 이렇게 해석을 해도 되는지 의문이 되어서요 농도가 증가할수록 sub G1기의 양이 늘어나는 것으로 보아 세포가 많이 사멸했다고 해석을 할 수 있는지요?? > 네, 세포가 죽기때문에 cell cycle에서 볼 수 있는 G1,S, G2/M의 피크가 사라진 거구요... 만약 apoptosis를 보구 싶으시다면, PI, Annexin V doulbe staining을 해보시면 더 확실히 아실 수 있으실 겁니다. necrosis인지 apoptosis인지..
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  • 답변

    강현태님의 답변

    2008-05-10
    • 0

    첨부파일

    >제가 암세포에 물질을 처리하여 PI염색을 하여 flow cytometry를 측정한것인데..결과가 다음과 같이 나왔습니다. 이것을 이렇게 해석을 해도 되는지 의문이 되어서요 농도가 증가할수록 sub G1기의 양이 늘어나는 것으로 보아 세포가 많이 사멸했다고 해석을 할 수 있는지요?? > DNA content를 이용한 cell cycle 분석의 결과를 보면, 이러한 형태는 전형적인 apoptosis에서 관찰이 됩니다. 간혹, necrosis와 apoptosis가 혼재된 형태의 cell death에선 sub-G1 peak가 발생하기도 합니다. 이를 apoptosis와 구분하는 간단한 방법은 FSC, SSC의 dot plot에서 세포의 분포가 약물 처리에 의해서 각각의 값이 줄어들면서 세포들이 분포하게 되면 apoptosis라고 잠정 결론을 내릴수 있습니다. PI, Annexin-V staining을 통해서 정확한 cell death 형태를 구분할 수 있지만, 일차적으로는 PI와 Acridine Orange(AO)라는 dye를 가지고 동시에 세포를 염색하고서 형광현미경으로 관찰을 해보는 방법이 있습니다. PI는 세포막이 손상되어야만 핵을 염색할 수 있지만, AO는 살아있는 세포의 핵도 염색을 할 수 있습니다. 1) PI-, AO+ cell -> 이는 세포막이 정상적인 살아있는 세포를 의미하며, AO에의한 핵 염색의 형태가 핵 전체에 이루어져있으면 살았는 세포를, 핵 염색이 spot의 형태를 띠면 apoptosis를 의미합니다. 2)PI+, AO+ cell -> 이는 이미 세포막이 손상된 죽은 세포를 의미하며, 이 때에도 AO의 핵 염색 형태를 통해서 apoptosis 유무를 판단할 수 있습니다. 이 실험에서 AO대신에 Hoechst33342와 같은 live cell staining이 가능한 DNA dye로 대체가 가능합니다. 그리고, 이 실험은 세포막의 손상 유무와 caspase-3에 의해서 활성화되는 CAD에 의한 DNA fragmentation의 유무를 통해서 cell death 형태를 판단하는 것이기 때문에 late apoptosis는 확인을 할 수 있어도 early apoptosis를 확인을 할 수 없습니다. 이를 위해선 PI, Annexin-V staining을 이용해야 합니다. FACS이외에 WB을 통해서도 apoptosis 여부를 판단할 수 있는데, 여기에는 caspase-3에 의한 PARP-1이라는 단백질의 단편화 여부를 통해서도 할 수 있습니다. 그 밖에, DNA ladder assay라는 방법도 있으니 참조를 하시고..... 예전에 강의에 이용했던 자료 중에서 필요한 부분만을 발췌해서 첨부하니 한 번 읽어보면 도움이 될 겁니다.
    답변수정
    >제가 암세포에 물질을 처리하여 PI염색을 하여 flow cytometry를 측정한것인데..결과가 다음과 같이 나왔습니다. 이것을 이렇게 해석을 해도 되는지 의문이 되어서요 농도가 증가할수록 sub G1기의 양이 늘어나는 것으로 보아 세포가 많이 사멸했다고 해석을 할 수 있는지요?? > DNA content를 이용한 cell cycle 분석의 결과를 보면, 이러한 형태는 전형적인 apoptosis에서 관찰이 됩니다. 간혹, necrosis와 apoptosis가 혼재된 형태의 cell death에선 sub-G1 peak가 발생하기도 합니다. 이를 apoptosis와 구분하는 간단한 방법은 FSC, SSC의 dot plot에서 세포의 분포가 약물 처리에 의해서 각각의 값이 줄어들면서 세포들이 분포하게 되면 apoptosis라고 잠정 결론을 내릴수 있습니다. PI, Annexin-V staining을 통해서 정확한 cell death 형태를 구분할 수 있지만, 일차적으로는 PI와 Acridine Orange(AO)라는 dye를 가지고 동시에 세포를 염색하고서 형광현미경으로 관찰을 해보는 방법이 있습니다. PI는 세포막이 손상되어야만 핵을 염색할 수 있지만, AO는 살아있는 세포의 핵도 염색을 할 수 있습니다. 1) PI-, AO+ cell -> 이는 세포막이 정상적인 살아있는 세포를 의미하며, AO에의한 핵 염색의 형태가 핵 전체에 이루어져있으면 살았는 세포를, 핵 염색이 spot의 형태를 띠면 apoptosis를 의미합니다. 2)PI+, AO+ cell -> 이는 이미 세포막이 손상된 죽은 세포를 의미하며, 이 때에도 AO의 핵 염색 형태를 통해서 apoptosis 유무를 판단할 수 있습니다. 이 실험에서 AO대신에 Hoechst33342와 같은 live cell staining이 가능한 DNA dye로 대체가 가능합니다. 그리고, 이 실험은 세포막의 손상 유무와 caspase-3에 의해서 활성화되는 CAD에 의한 DNA fragmentation의 유무를 통해서 cell death 형태를 판단하는 것이기 때문에 late apoptosis는 확인을 할 수 있어도 early apoptosis를 확인을 할 수 없습니다. 이를 위해선 PI, Annexin-V staining을 이용해야 합니다. FACS이외에 WB을 통해서도 apoptosis 여부를 판단할 수 있는데, 여기에는 caspase-3에 의한 PARP-1이라는 단백질의 단편화 여부를 통해서도 할 수 있습니다. 그 밖에, DNA ladder assay라는 방법도 있으니 참조를 하시고..... 예전에 강의에 이용했던 자료 중에서 필요한 부분만을 발췌해서 첨부하니 한 번 읽어보면 도움이 될 겁니다.
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