2008-06-02
org.kosen.entty.User@4df75a27
전정민(wjdals98)
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교수님과 같이 상의해봤지만, 확실한 결론을 못내려서 물어볼께요..
긴 글이 될것 같지만, 정말 답답해서 그래요..
1) 먼저 T vector에 클로닝한 insert를 E.coli DH5a에 transformation 성공
=> 플라스미드 프렙 후 enzyme으로 잘라본 결과 클로닝 된 것이 확인
2) (1)에서 플라스미드를 프렙 후 엔자임으로 자른 후 insert 크기의 product를 elution 한 후 유산균 벡터 pTRKL2와 ligation 한 후 heat-shock으로 transformation 하여 다시 E.coli에 DH5a에 sub -cloning 성공
=> pTRKL2는 유산균과 이콜라이의 ori gene을 갖고 있음.
=> 유산균에 직접 하는것보다 먼저 이콜라이에 유산균 벡터를 집어넣는 작업이 쉽기 때문에 sub- cloning하였음. 이 경우도 마찬가지로 엔자임으로 잘라봤을때 insert 와 벡터 크기 확인
3) (2)의 plasmid를 이용하여 유산균에 electroporation을 통해 transformation 성공
=> 항생제 Erm이 깔려있었고, 콜로니가 50개 이상 뜸
=> 콜로니를 따서 유산균 키우는 배지에 접종하여 엔자임 활성도 측정했을때 확실히, wild type 에 비해 큰 차이를 보여, transformation이 ？榮鳴？가정함
4) 이 transformant를 유산균 플라스미드 프렙을 하려 했으나 워낙 low copy라서 플라스미드를 관찰 못함 => chromosome 크기의 밴드만 희미하게 보여, 플라스미드가 있을 것이라 생각하고 이 plasmid prep product를 다시 electroporation or heat shock 이용해서 이콜라이에 다시 집어넣음
5) 문제는 여기서부터..이콜라이 플라스미드 프렙을 실시했으나, 아무 밴드도 나타나지 않았음..
** 같은 방법으로 control로 사용된 insert가 들어있지 않는 pTRKL2의 플라스미드 prep을 해보았으나, 이 경우는 플라스미드 prep이 제대로 되었음.
** 제가 넣은 insert에 어떤 문제가 있는 것 같은데, 도대체 왜 이럴까요??
정말 답답하네요...이 해답이 풀려야 다음 단계로 넘어가야 할텐데..궁금해요..
고수님들 알려주세요,ㅠ.ㅠ
- transformation
- plasmid prep
- enzyme
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답변 2
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답변
서기원님의 답변
2008-06-02- 0
님께서 말한 실험 내용이. 사실이고.. 정확하게 실험 하신 거라 가정하면,, insert DNA가 삽입된 vector가 유산균의 genomic DNA에 삽입될 가능성이 하나 있네요.. 드물게 일어날수 있습니다.. 다시 말씀드리면, recombination이 일어났을수 있다는 얘김니다.. PCR 해보세요.. 유산균 genomic DNA prep해서... cloning 하셨으면 당근 primer는 갖고 계시겠죠?? 저도 아는게 없어.. 이정도.. 많이 갑갑하실것 같아.. 지푸라기라도 잡아 보시라구.. ^^ 좋은 결과 얻으세요.. -
답변
정철웅님의 답변
2008-06-03- 0
두 가지의 가설의 오류가 있을 수 있을 것 같습니다. >3) (2)의 plasmid를 이용하여 유산균에 electroporation을 통해 transformation 성공 >=> 항생제 Erm이 깔려있었고, 콜로니가 50개 이상 뜸 >=> 콜로니를 따서 유산균 키우는 배지에 접종하여 엔자임 활성도 측정했을때 확실히, wild type 에 비해 큰 차이를 보여, transformation이 ？榮鳴？가정함 ==> 몇개의 colony를 확인 해 보셨는지요? ==> cloning 한 것이 특정 enzyme인 것 같은데 활성의 큰 차이라는 것이 통계적으로 얼마나 유의성이 있는 것인지요? 혹시 western blot을 통해서 발현양을 확인 해 보시거나 RT - PCR로 확인 해보셨는지요. >4) 이 transformant를 유산균 플라스미드 프렙을 하려 했으나 워낙 low copy라서 플라스미드를 관찰 못함 => chromosome 크기의 밴드만 희미하게 보여, 플라스미드가 있을 것이라 생각하고 이 plasmid prep product를 다시 electroporation or heat shock 이용해서 이콜라이에 다시 집어넣음 > >5) 문제는 여기서부터..이콜라이 플라스미드 프렙을 실시했으나, 아무 밴드도 나타나지 않았음.. ==> 4에서 보이지도 않는 플라스미드가 있을 거라고 가정하신 것 자체가 잘 못 되었을 있습니다. 4의 plasmid prep product에서 pcr로 band가 amplify 되는 지 확인 바랍니다.