2008-06-11
org.kosen.entty.User@795c67a2
오용식(rockeryosi)
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insert DNA를 8~10 kb 정도로해서 E.coli에 cloning하려하는데요,,
high copy number plasmid를 사용하더라도 cloning이 제대로 될 수 있을까요??
아니면 copy number와 상관없이 아무 plasmid를 사용해도 될까요?
답변부탁드려요 ^^;
- cloning
- insert size
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답변 6
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오용식님의 답변
2008-06-12- 0
internal enzyme site에 넣는다는게 어떤개념이죠? 제가 아는게 얼마 없어서,, 이해가 잘 안되네요 ^^;; 가지고 계신 자료라도 있으시면, 공유해주실 수 있을까요?? ^^ -
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오용식님의 답변
2008-06-12- 0
먼저 답변 감사드립니다. ^^ 제가 인터넷을 돌아다니다보니 pBluescript에 14kb까지 넣었다는 글이 있더라고요,, 각 plasmid마다 들어갈 수 있는 insert size가 다른거 같은데, 혹시 이런 정보를 알 수 있는 site나 자료 좀 알 수 있을까요? 도움 부탁드립니다., -
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정철웅님의 답변
2008-06-12- 0
>insert DNA를 8~10 kb 정도로해서 E.coli에 cloning하려하는데요,, >high copy number plasmid를 사용하더라도 cloning이 제대로 될 수 있을까요?? >아니면 copy number와 상관없이 아무 plasmid를 사용해도 될까요? > >답변부탁드려요 ^^; insert DNA가 8~10 kb 된다면 vector에 한번에 넣으려고 하지 마시고 internal enzyme site를 이용하여 2-3번에 나누어 넣을 수 있는 방법을 모색해 보세요 그게 시간을 더 절약할 수 있을 것입니다. 이 경우 copy number 보다는 enzyme site가 더 중요 하겠죠?^^; -
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정철웅님의 답변
2008-06-12- 0
insert DNA가 8~10 kb 정도 되면 왠만한 restriction enzyme site가 존재할 수 있어서 primer design이나 vector선정에 어려움이 있습니다. 예를 들어 중간에 BamHI, EcoRI 같은 효소가 존재 하고 vector에 cloning site에도 있을 경우 일반적으로는 이 효소들을 이용하기 힘든데, 오히려 그 site를 이용해서 토막내서 잘라 낸 다음 조각조각을 차례대로 집어넣는 것입니다. 어떻게 보면 돌아가는 길인데 오히려 시간 단축이 될 수 있고 중간 산물은 domain연구에도 활용할 수 있을 것입니다. -
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여인철님의 답변
2008-06-12- 0
>insert DNA를 8~10 kb 정도로해서 E.coli에 cloning하려하는데요,, >high copy number plasmid를 사용하더라도 cloning이 제대로 될 수 있을까요?? >아니면 copy number와 상관없이 아무 plasmid를 사용해도 될까요? > >답변부탁드려요 ^^; 저도 4.1Kb 까지는 해보았는데..... 사용되는 vector마다 이용할 수 있는 vector의 특성이 있습니다. 8~10Kb?? 1Kb ladder를 running 하였을 때 가장 위에 보이는 band가 10kb 입니다. insert DNA 의 크기가 그렇게 크다면 copy number를 생각마시고 사용할 vector를 결정하는 것이 중요하다고 봅니다. insert를 vector가 수용못하면 cloning 안된다고 생각하시면 됩니다. 그리고 cloning 실험 방법(TA cloning, LR reaction 등)과 cloning 후 연결되는 실험(transformation, transfection 등) 등을 고려해서 vector를 골라야 하겠죠.. high, low copy number와 같은 문제는 DNA prep. 방법을 바꾸는 것으로도 얼마든지 만회할 수 있다고 봅니다. 정답은 아니지만 도움이 되셨으면 합니다. 그럼 수고하세요~ -
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여인철님의 답변
2008-06-13- 0
>insert DNA를 8~10 kb 정도로해서 E.coli에 cloning하려하는데요,, >high copy number plasmid를 사용하더라도 cloning이 제대로 될 수 있을까요?? >아니면 copy number와 상관없이 아무 plasmid를 사용해도 될까요? > >답변부탁드려요 ^^; 가장 간편하면서 쉬운 방법은 회사를 통한것입니다.^^; 요즘엔 신형 vector들이 워낙 많이 개발되기 때문에 vector를 취급하는 회사 홈페이지..또는 catalog를 이용해 찾아보는 것이 좋겠죠. 그리고 이전에도 말씀드렸지만 cloning후의 실험이 어떤 실험이냐에 따라 vector선정도 중요하고, 또한 cloning후 확인 과정에 필요한 vector안에 있는 restriction enzyme site를 선정하는 것도 신경쓰셔야 할 껍니다.