2008-07-18
org.kosen.entty.User@318b1648
서기원(majimotai)
- 2
yeast 에서 단백질을 발현시켜서요.. PAGE와 western blot을 하여 확인하고자 합니다..
yeast lysis 효과적으로 시키는 방법좀 알려 주세요..
buffer 조성, chemical, enzyme 등등요..
특히 세포막에 발현하는 것이라.. PAGE와 western blot을 한번 해보았는데요.. 잘 안나오네요.. 아무래도.. 세포막에서 잘 분리가 일어나지 않는것 같습니다..
- yeast
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 2
-
답변
김성훈님의 답변
2008-07-18- 0
어떤 단백질을 정확하게 어디에다 발현시키는지 가르쳐주시면 답변을 정확하게 드릴수 있는데 정보가 부족하군요. 저같은 경우에 ER targeting 단백질인 oligosaccharyltransferase를 ER membrane에 발현시켜서 분리 정제하는 일을 하고 있습니다만... 샘플을 준비할때 일반적으로 쓰는 SDS-PAGE sample buffer를 사용해서 boiling을 하게 되면 발현된 단백질을 Western blot으로도 측정이 불가합니다. Sample buffer에 6 M UREA를 넣은 샘플 버퍼를 이용하셔서 glass bead를 넣은후 cell lysis후에 40도에서 20분간 incubation 을 한후 원심분리를 통해 얻은 soluble fraction을 gel running을 하면 단백질을 관찰할수 있을겁니다. 좋은 결과 얻길 바라면서... -
답변
윤영민님의 답변
2008-07-19- 0
제 생각에도 발현된 단백질을 회수하는 방법을 강화시켜야 할 것 같습니다. 가장 기본적인 질문은 “yeast에서 발현된 단백질은 어디에 축적되나요?“입니다. 배지로 배출된다면 다행이지만 그런 경우는 아닐거고, 대부분 세포막내에 축적되든지, 최소한 세포막에 부착된 형태가 아닐까 싶습니다. 세포막에 부착된 형태는 부착물질을 알아보시고 (대개 지질 성분입니다) 이것을 선택적으로 녹여내여 단백질을 분리해서 측정하셔야 합니다. 대부분의 경우 세포 안에 축적되는데, 이럴 때는 당연히 세포를 잘 깨서 세포의 구성물질과 단백질이 배지에 분산된 상태에서 측정 및 회수를 하셔야 겠지요. 세포막을 깨는 방법은 위에서 답변주신 방법 외에도 호모게나이징, 화학적 방법 등이 있습니다. 화학적인 방법은 세포막을 선택적으로 (최소한 회수해야 할 단백질을 손상시키지 않게) 분해하는 방법이고요, 대부분 호모게나이징 방법을 사용합니다. 여기서 호모게나이징이란 세포내외의 모든 물질을 더 분산시킨다는 것인데요, 구체적인 타입은 1. 기어타입(기어사이에서 세포를 잘게 깨주는 거지요) 2. 압력차타입(통산 10000psi 이상의 고압에서 갑자기 상압으로 내려주는 겁니다. 마치 세포가 우주에 나가면 압력이 저하되어 터지는 것과 같은 현상을 만드는거죠) 등이 있습니다. 호모게나이저 란 단어로 검색해보셔도 좋을 것 같습니다. >yeast 에서 단백질을 발현시켜서요.. PAGE와 western blot을 하여 확인하고자 합니다.. >yeast lysis 효과적으로 시키는 방법좀 알려 주세요.. >buffer 조성, chemical, enzyme 등등요.. > >특히 세포막에 발현하는 것이라.. PAGE와 western blot을 한번 해보았는데요.. 잘 안나오네요.. 아무래도.. 세포막에서 잘 분리가 일어나지 않는것 같습니다.. >