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제 경험상 비추어 보면요, -> 원하는 밴드가 뜨나 배경이 너무 지저분해서 전체적으로 봤을때 좋은 데이터라고 볼 수 없음 이 부분의 경우 blocking 이 잘 안된듯 싶습니다. (blocking이 너무 많이 되었던지 아니면, blocking 후 단백질이 membrain에 남아 있어 그 단백질과 antibody가 반응하는 경우도 있더군요) 상온에서 blocking을 하셨다고 하는 데, 일단 4 ℃에서 해보시길 바랍니다. 한시간이면 충분할 거예요. 또한 전기영동 후에 transfer 과정으로 넘어 갈 때, membrain이 마르지 않는 지, blocking 하기 전에 마르지 않는 지 확인 해 보시구요 , 축축하게 젖어 있지 않으면 가끔 잡벤드같은 것이 생기거나 백그라운드가 무지 지저분하게 나더라구요.. 그리고 1차와 2차 antibody 의 희석액을 각 antibody 회사에서 권장하는 방법으로 사용했는 지 다시 확인해보시구요 밴드가 안나오는 경우에는 일단 antibody희석율을 좀 높여서 하시는 게 좋을 것 같습니다. 지금 3가지 실험을 올리셨는 데, control로 잡아 둘 것이 없는 데요 , 하나씩 바꿔 가면서 문제점을 찾는 것이 좋을 것 같구요 ... 또 하나 마지막으로 한가지는 요 .. ECL을 1분 정도 반응 시키고 membrain에 있는 ECL를 충분히 제거 한 후에 찍으셨는지요 ..? 3번째 문제의 경우 ECL이 많이 남아 있을 때 저런 경우가 있어서요 .. 그럼 화이팅 하세요 ^^

1. blocking 시간이 너무 짧네요. 새것으로 해서 다시 만드세요. 냉장보관 했던것 쓰지말고 2. antibody가 제대로 working하는지 확인 먼저 하세요 액틴이 나오도록 조건을 조절해 보세요.

>안녕하세요 > >실험을 하다 여러번의 실패 끝에 안되겠다 싶어 이렇게 글 남깁니다. > >요즘 Western blot을 하는데 이게이게 정말이지.... 말썽이네요. > >필름 현상을 하면 너무 많이 타서 데이터 발표할때 실험을 제대로 했다고 보여 드리기에 부끄러울 정도 인데요..... 아휴~~ > >그래서 제 나름대로 실험 방법을 바꿔 봤습니다. > >첫번째 실험 > >- 5% blocking - 상온 / 3hr >- 1차 = 1 : 1000 in 1% PBST (Tween -0.05%) / 4℃ / overnight >- washing = 5min x 4 >- 2c차 = 1: 10000 in 1% PBST (Tween -0.05%) / 상온 / 1hr >- washing = 5min x 4 >- 2-5min expose (5분 이상하면 필름이 완전히 다 타요~) > >--> 원하는 밴드가 뜨나 배경이 너무 지저분해서 전체적으로 봤을때 좋은 데이터라고 볼 수 없음 > >두번째 실험 > >- 8% blocking - 상온 / 3hr >- 1차 = 1 : 3000 in 3% PBST (Tween -0.05%) / 4℃ / overnight >- washing = 3min x 5 >- 2c차 = 1: 8000 in 3% PBST (Tween -0.05%) / 상온 / 1hr >- washing = 3min x 5 >- 2-5min expose (5분 이상하면 필름이 완전히 다 타요~) > >--> 첫번째 실험결과와 크게 다르지 않음 > >세번째 실험 > >- 10% blocking - 상온 / 2hr >- 1차 = 1 : 1000 in 3% PBST (Tween -0.1%) / 4℃ / overnight >- washing = 3min x 5 >- 2c차 = 1: 12000 in 3% PBST (Tween -0.1%) / 상온 / 1hr >- washing = 3min x 5 >- 5min exposure / membrane 테두리만 까맣게 한줄로 나타남 > >--> 실험결과, 배경이 깨끗하게 현상됨. > 하지만 앞선 실험에서 뜨던 밴드 조차 나타나지 않음. > > > >세번째 실험을 할땐 ECL solution도 바꾸고 developer / fixer도 한꺼번에 바꿨는데 한번에 너무 많은 조건을 바꿔서 그런지 어디서부터가 잘못됐는지 감을 못 잡겠네요.... > >필름이 현상되는 상태를 봤을때 developer / fixer는 문제가 아닌 것 같고요.. (어차피 이건 희석만 하면 되는 거니깐요...) > >PBST를 만들때 Tween 농도를 0.05% --> 0.1%로 높혀서 사용했는데요, > >이것이 문제가 될까요?? Western blot시 troubleshooting으로 코멘트 해놓은 책자를 봤는데 tween 농도를 조절하면 배경이 까맣게 타는 현상을 조절할 수 있을꺼라 돼 있던데.... > >그래서 tween 농도를 두배로 높혀 봤더니 까만 배경이 없어지긴 했는데 원하는 밴드마저 사라져 버렸으니 > >걱정입니다. 그리고 저희 >랩에 advanced ECL solution이라고 해서 엄청 적은 양의 단백질에도 반응하는데 > >웬일인지 이번 세번째 실험방법으로 했더니 어떤 밴드도 잡히지 않았어요. > >원래 이 ECL solution을 사용할땐 높은 농도로 희석하거나, 필름을 3장 깔고서 2분 이내로 반응시키는데 > >이번엔 희석도 하지 않고 필름 한장에 2분 이상 반응시켰음에도 불구하고 어떤 밴드도 나타나지 않았어요 > >그래서 tween 농도가 너무 높아서 membrane washing 할때 붙어 있던 항체들이 왕창 다 씻겨 내려간게 아닌가하는.... 쩝... > >western blot시 PBST에 들어가는 Tween 농도가 실험결과에 큰 영향을 미칠까요?? > >제가 생각하기엔 tween 때문에 세번째 실험결과가 꽝인게 아닌가 싶은데..... > >지금 제가 겪고 있는 이 문제에 대해 어떻게 생각하세요??? > >어떻게 하면 좋은 결과를 얻을 수 있을지 답변 부탁 드립니다. > >답답하네요...아흑... (ㅠ.ㅠ) > > 일단 1번째 시도에서 원하는 밴드가 나왔다고 했으니까, blocking solution의 선택은 ？I챤은 것 같네요. 요는 노출을 최소화할려고 해도 과다노출이 된다는 건데, 이럴땐 제일 간단한 방법은 western시에 사용되는 cell extract의 양을 줄이는 것이 좋습니다. 이와 동일한 효과를 줄 수 있는 것은 primary ab와 secondary ab의 양을 지금 사용하는 양의 절반 이하로 사용하는 방법이 있습니다. 이외에, 1번째 시도에 이용했던 blocking solution을 한시간만 하고, primary ab를 역시 한 시간만 하고, secondary ab도 한 시간만 하세요. 굳이 잘 나오는 ab를 over night로 incubation할 필요는 없습니다. 괜히 시간만 오래 걸리니까, 이럴 땐 1시간 정도만 incubation해도 왠만한 ab는 signal이 잘 나옵니다. 그리고, 비교적 western 실험 초보자들이 볼 만한 자료를 첨부하니 한 번 읽어보세요. 그나마, 이렇게 ab가 잘 작용해서 과다노출될 때는 여러 가지 해결 방법이 있지만, ab가 제대로 작동하지 않을 때는 아주 골치를 썩인답니다. 그러니, 윗 분과 제가 제시한 해결 방법으로 한 두번 더 시도해보시면 좋은 결과를 얻을 수 있을거라고 봅니다.

blocking은 상온에서 1시간 정도로 하시고.. 저는 1st Ab를 상온에서 1시간 혹은 4도에서 overnight을 합니다. 여기선 PBST 사용안합니다. 그리고 washing은 PBS이고요. 그 다음에 2nd Ab를 역시 상온에서 1시간 반응합니다. 그 후 이 단계에서 PBST를 사용하는데요. 3분씩 6번을 합니다. 그럼 왠만큼 Ab가 더럽지 않다면...깨끗하게 나옵니다. 지극히 개인적인 성향이지만..Goat 유래 Ab가 상당히 더럽더라구요~ ^^; 좋은 결과 얻으세요~