KOSEN 한인과학기술자네트워크

천천히 키트에 첨부되 설명서를 읽어보시면 이해하실 수 있을 거라고 생각합니다만.... 간단하게 설명을 드리겠습니다. 일반적으로 효소의 활성을 측정하기 위해서는 특정 기질을 이용하여 단위 시간 당 기질이 효소에 의해 변환되는 것을 측정합니다. 즉, 생성된 산물의 양을 측정하여 표시하는 것이 대부분인데, 일반적인 전분 분해 효소의 경우에는 생성된 산물인 환원당의 양을 비색법으로 측정하죠. 님께서 사용하시는 키트의 경우도 베타-세크리테이스는 특정 아미노산 잔기를 인식하여 절단하는 단백질 분해효소이므로 특정 아미노산 서열을 갖는 기질에 형광성 탐침 (나중에 정량을 위해서 형광 강도를 측정)을 결합시켜 FRET라는 원리를 이용해서 효소에 의해 기질이 잘려지면 일정 파장에서 검출이 되도록 만든 것 입니다. 분해된 기질의 양을 알 수 있도록 이미 농도를 알고 있는 reference standard를 같이 plate에 로딩하여 단위 시간당 분해된 기질의 양을 확인 하도록 되어 있죠. 한번 더 전분분해효소를 예로 설명을 드리면, 표준 효소가 전분분해효소 (활성을 알고 있는 시판 효소)일 경우에 님께서 사용하시는 키트의 Human β-secretase (component F)이고, 전분이 기질 즉, 키트의 β-Secretase substrate (component A)이고, reference standard인 환원당 측정용 포도당 용액이 키트의 HiLyte Fluor™ 488 (component B)인 겁니다. 미지의 시료에 포함된 타겟 효소의 활성을 표준 효소의 활성과 비교하여 계산하는 것이지요. 환원당은 여러 가지 방법이 있지만 간단하게 비색법에 많이 사용되는 DNS 시약과 반응시킨 후 spectrophotometer로 측정합니다만, 님께서는 fluorometer로 측정해야만 합니다. fluorometer의 경우도 spectrophotometer를 특정 필터를 이용하여 간단하게 plate로 다수의 시료를 동시에 측정할 수 있듯이 microplate용 fluorometer를 사용하시면 됩니다. plate의 경우도 매뉴얼에 있듯이 전용 black microplate를 사용하시면 됩니다. 이하의 내용은 일반적인 교과서에 나온 효소의 활성 측정법을 참고하시길 바랍니다. 효소의 반응속도, 저해제의 사용 등등.... 그리고 실험과정 중에 모르시는 부분이 있다면 주위 실험실의 선배 혹은 경험이 있는 분들께 직접 물어보시는 편이 좋습니다. 일을 시키신 교수님께 직접 여쭈어보는 것도 좋지요.^^ 수고하세요. >석사 1학기인데 교수님께서 beta-secretase 활성을 측정하라는 요구를 하셔서 > >ANASPEC 회사의 SensoLyte 520 beta-secretase Assay Kit를 구입하였는데, > >어떻게 사용하는지 도저히 모르겠습니다. > >protocol을 읽어봐도 잘 모르겠구요.... > >첨부파일에 protocol 첨부하였으니 고수님들 제발 알려주세요...^^ > >그리고 beta-secretase 활성 측정 Kit중 좋은게 있으면 추천해 주세요..^^