KOSEN 한인과학기술자네트워크

닫기

더 많은 혜택을 위해
로그인 하세요.

지식나눔

지식나눔

Gene cloning

2008-09-12 org.kosen.entty.User@795acaa3 이승구(elitelin)
  • 1

첨부파일

안녕하세요. 박사과정학생입니다. cloning을 했는데 문제가 생겨서 문의드립니다. primer는 enzyme site를 포함시켰고, mRNA를 얻어 cDNA를 합성한후에 primer를 이용해 증폭한후에, TA vector에 넣어 clone을 얻었고, sequencing해서 확인했습니다. 다음으로 mamalian expression vector인 pcDNA3.1mychis vector에 넣었는데 발현이 되지 않아서 이렇게 문의 드립니다. Gene-forward-EcoR V ACGCgatatcATGTCCCATCACTGGGGGTACGGCAAACAC Gene-Reverse- XhoI ACGCctcgagTTTGAAGGAAGCTTTGATTTGCCTGTTCTTCAGTGG forward에는 ATG (start site)넣어고 뒷부분의 stop code은 vector에 포함되어 있어서 빼고 construct를 제작했습니다. subcloning할때는 pcDNA3.1(+)=myc-His B에 넣었고, 원하는 size의 insert를 확인 할 수 있었습니다. 293T cell에 electrophoration해서 48시간후에 (GFP vector로 잡았던 조건을 사용했습니다) western했는데, 10개 clone을 사용했는데 모두 발현이 되지 않아서요. frame도 맞고, 잘 못된게 없는것 같은데 뭐가 문제인지.... 선배님들의 많은 조언 부탁드립니다.
  • Gene
  • cloning
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변! 
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변하기
답변 1
  • 답변

    김은민님의 답변

    2008-09-12
    • 0
    안녕하세요? Myc과 His는 N-terminus에 원하는 단백질과 fusion되어 만들어지는 것으로 보입니다. Frame은 sequencing으로 확인해보셨다는 말씀이시지요? 혹시 mRNA에서 cDNA를 합성한 후에 PCR로 증폭하시고, full length에 정말 아무문제가 없는지 꼼꼼히 살펴보셨나요? 혹시 PCR 에러로 생기는 stop codon이나 single nucleotide deletion은 발견하시지 않으셨나요? 모두 확인하셨다면, 단백질의 발현양이 너무 적지는 않은지 확인해보세요. GFP로 fusion한 단백질로는 확인하셨던것 같네요.그때 발현양이 적진 않았는지 확인해보시기 바랍니다. 마지막으로.. 사용하신 안티바디의 문제는 없는지.. positive control을 함께 gel 에 loading하여 western 하였나요? 그것도 아니라면, tagging이 짧아지면서 (GFP보다) 세포 내에서 어떤 다른 일이 일어난 것일수도 있구요. ^^ 도움이 되셨으면 좋을텐데.. 아자아자 힘내시구요. 추석 즐겁고 두둑하게 보내세요~ >안녕하세요. 박사과정학생입니다. > > >cloning을 했는데 문제가 생겨서 문의드립니다. > >primer는 enzyme site를 포함시켰고, >mRNA를 얻어 cDNA를 합성한후에 primer를 이용해 증폭한후에, TA vector에 넣어 clone을 얻었고, >sequencing해서 확인했습니다. > >다음으로 mamalian expression vector인 pcDNA3.1mychis vector에 넣었는데 >발현이 되지 않아서 이렇게 문의 드립니다. > >Gene-forward-EcoR V >ACGCgatatcATGTCCCATCACTGGGGGTACGGCAAACAC > >Gene-Reverse- XhoI >ACGCctcgagTTTGAAGGAAGCTTTGATTTGCCTGTTCTTCAGTGG > >forward에는 ATG (start site)넣어고 뒷부분의 stop code은 vector에 포함되어 있어서 빼고 >construct를 제작했습니다. >subcloning할때는 pcDNA3.1(+)=myc-His B에 넣었고, 원하는 size의 insert를 확인 할 수 있었습니다. >293T cell에 electrophoration해서 48시간후에 (GFP vector로 잡았던 조건을 사용했습니다) >western했는데, 10개 clone을 사용했는데 모두 발현이 되지 않아서요. >frame도 맞고, 잘 못된게 없는것 같은데 뭐가 문제인지.... > >선배님들의 많은 조언 부탁드립니다.
    답변수정
    안녕하세요? Myc과 His는 N-terminus에 원하는 단백질과 fusion되어 만들어지는 것으로 보입니다. Frame은 sequencing으로 확인해보셨다는 말씀이시지요? 혹시 mRNA에서 cDNA를 합성한 후에 PCR로 증폭하시고, full length에 정말 아무문제가 없는지 꼼꼼히 살펴보셨나요? 혹시 PCR 에러로 생기는 stop codon이나 single nucleotide deletion은 발견하시지 않으셨나요? 모두 확인하셨다면, 단백질의 발현양이 너무 적지는 않은지 확인해보세요. GFP로 fusion한 단백질로는 확인하셨던것 같네요.그때 발현양이 적진 않았는지 확인해보시기 바랍니다. 마지막으로.. 사용하신 안티바디의 문제는 없는지.. positive control을 함께 gel 에 loading하여 western 하였나요? 그것도 아니라면, tagging이 짧아지면서 (GFP보다) 세포 내에서 어떤 다른 일이 일어난 것일수도 있구요. ^^ 도움이 되셨으면 좋을텐데.. 아자아자 힘내시구요. 추석 즐겁고 두둑하게 보내세요~ >안녕하세요. 박사과정학생입니다. > > >cloning을 했는데 문제가 생겨서 문의드립니다. > >primer는 enzyme site를 포함시켰고, >mRNA를 얻어 cDNA를 합성한후에 primer를 이용해 증폭한후에, TA vector에 넣어 clone을 얻었고, >sequencing해서 확인했습니다. > >다음으로 mamalian expression vector인 pcDNA3.1mychis vector에 넣었는데 >발현이 되지 않아서 이렇게 문의 드립니다. > >Gene-forward-EcoR V >ACGCgatatcATGTCCCATCACTGGGGGTACGGCAAACAC > >Gene-Reverse- XhoI >ACGCctcgagTTTGAAGGAAGCTTTGATTTGCCTGTTCTTCAGTGG > >forward에는 ATG (start site)넣어고 뒷부분의 stop code은 vector에 포함되어 있어서 빼고 >construct를 제작했습니다. >subcloning할때는 pcDNA3.1(+)=myc-His B에 넣었고, 원하는 size의 insert를 확인 할 수 있었습니다. >293T cell에 electrophoration해서 48시간후에 (GFP vector로 잡았던 조건을 사용했습니다) >western했는데, 10개 clone을 사용했는데 모두 발현이 되지 않아서요. >frame도 맞고, 잘 못된게 없는것 같은데 뭐가 문제인지.... > >선배님들의 많은 조언 부탁드립니다.
    등록된 댓글이 없습니다.
목록
목록