KOSEN 한인과학기술자네트워크

업로드하신 화일을 본 바에 의하면, 제가 생각하기엔 genomic DNA contamination같습니다. transcription start site를 찾기위해서 가장 좋은 방법은 primer extension assay를 이용하는 것입니다. 이를 통해 정확한 TSS를 찾을 수 있습니다. 이걸 가장 먼저 해봐야 할 듯 싶습니다. 그리고 intron이 promoter역할을 할 수 있다는 논문들도 꽤 되니까 그것들을 reference로 삼아 실험을 해보시면 좋을 듯 싶습니다. >R gene의 genomic DNA로 부터 PCR을 통해 cloning을 시작으로 R gene expression 조절을 보기 위해 promoter study를 마치고 EMSA까지 해서 target factor까지 현재 잡아놓은 상태입니다. 문제는... > >R gene에 관한 최근 논문을 보고난 후, 그들이 잡은 promoter region이 조금 다르다는 것을 알게고 자세히 확인하고 보니 지금까지 제가 R gene의 promoter region이라고 알고 있던 영역이 Intron 부분이라는 것을 알게 되었습니다.(NCBI내 염기서열분석 비교) > > -----EXON1-------(Intron 약 10,000bp)-----EXON2-------AT(U)G-------- > F-Primer① F-Primer② R-Primer > >위와 같은 모습이구요, 저는 ATG로 부터 3.6KB upstream region을 promoter가 존재할거라 예상하고 실험을 진행했습니다. 다른 논문저자들은 당연히, ATG로 부터 시작해서, intron 부분을 피해 gene을 증폭 후 promoter study를 진행했구요... > >신기하게도 제가 design한 intron 포함된 R DNA를 가지고도 luciferase assay에서도 그랬고 EMSA data의 data가 의미있게 나왔다는 것입니다. 이건 문제가 아니구요... > >그래서, 아래와 같은 가정하에 확인 실험을 진행했습니다. > >1) EXON1쪽과 EXON2쪽에 가까운 intron 영역에 포함된 sequence를 바탕으로 forward primer를, ATG 뒤쪽에서 시작되는 reverse primer를 준비했습니다. 만약 제가 실험해온 promoter 부분이 정말 intron이고, 염기서열분석 결과가 맞다면 RT-PCR 시 'F-Primer②~R-Primer'에 의해 합성되어지는 것을 없을 것이고, 'F-Primer①~R-Primer'에 의한 transcript는 생성될 것. > >-> 두 가지 모두에서 product가 있음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 intron이라고 알려지긴 했으니 나름 의미있는 일이라 잠시동안 생각할 수 있었습니다. > >2) 위 결과를 바탕으로, RT-PCR을 통해 간략하게나마 transcription start site를 예측하기 위해 deletion study에 사용했던 primer를 가지고 RT-PCR을 해보았습니다. ATG로 부터 -200. -400, -500, -600, -700, -800, -900, -1200, -1600bp 까지.... > >-> luciferase assay+EMSA를 통해 promoter로 작용할 수 있는 부분이 -510bp 부근이라는 결과를 실험을 통해 알 수 있었는데, RT-PCR 결과... product가 모든 곳에서 나옵니다. > >3) 위 문제가 prep.한 RNA내 genomic DNA가 존재해서 일어나는 일이 아닌가 해서, RN>A 추출 후 DNaseⅠ으로 다시 digestion 한 뒤 cleanup 해서 위 두 실험을 동일하게 반복해보았습니다. > >-> 결과, 이전 1)/2) 실험 결과와 똑 같은 data가 나옵니다. > > >왜 이런 결과가 나오는지 많이 생각해봐도 머리가 나빠서 좋은 아이디어를 얻을 수가 없네요. 스쳐가는 의문점이라도 좋으니, 작은 조언이라도 해주셨으면 좋겠습니다. > > >P.S 업로드한 PPT에서 1번 슬라이드는 위 1)번 실험결과를 나타내구요, 2번 슬라이드가 2)번 결과를, 나머지 3/4번 슬라이드가 3)번 결과를 의미합니다.

제가 실험하던 유전자도 두개의 프로모터가 있었어요 1번 엑손과 2번 엑손 사이에 있는 것을 연구했습니다. 그리고 RT-PCR 결과를 보니 reverse transcriptase를 넣지 않고 RT-PCR한 결과가 보이지 않습니다. DNase I 처리후 RTase를 넣지 않은 RT- control을 요새 논문에 많이 넣고 있습니다. 혹시 안하셨다면 genomic DNA contamination을 확인해보세요. >R gene의 genomic DNA로 부터 PCR을 통해 cloning을 시작으로 R gene expression 조절을 보기 위해 promoter study를 마치고 EMSA까지 해서 target factor까지 현재 잡아놓은 상태입니다. 문제는... > >R gene에 관한 최근 논문을 보고난 후, 그들이 잡은 promoter region이 조금 다르다는 것을 알게고 자세히 확인하고 보니 지금까지 제가 R gene의 promoter region이라고 알고 있던 영역이 Intron 부분이라는 것을 알게 되었습니다.(NCBI내 염기서열분석 비교) > > -----EXON1-------(Intron 약 10,000bp)-----EXON2-------AT(U)G-------- > F-Primer① F-Primer② R-Primer > >위와 같은 모습이구요, 저는 ATG로 부터 3.6KB upstream region을 promoter가 존재할거라 예상하고 실험을 진행했습니다. 다른 논문저자들은 당연히, ATG로 부터 시작해서, intron 부분을 피해 gene을 증폭 후 promoter study를 진행했구요... > >신기하게도 제가 design한 intron 포함된 R DNA를 가지고도 luciferase assay에서도 그랬고 EMSA data의 data가 의미있게 나왔다는 것입니다. 이건 문제가 아니구요... > >그래서, 아래와 같은 가정하에 확인 실험을 진행했습니다. > >1) EXON1쪽과 EXON2쪽에 가까운 intron 영역에 포함된 sequence를 바탕으로 forward primer를, ATG 뒤쪽에서 시작되는 reverse primer를 준비했습니다. 만약 제가 실험해온 promoter 부분이 정말 intron이고, 염기서열분석 결과가 맞다면 RT-PCR 시 'F-Primer②~R-Primer'에 의해 합성되어지는 것을 없을 것이고, 'F-Primer①~R-Primer'에 의한 transcript는 생성될 것. > >-> 두 가지 모두에서 product가 있음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 intron이라고 알려지긴 했으니 나름 의미있는 일이라 잠시동안 생각할 수 있었습니다. > >2) 위 결과를 바탕으로, RT-PCR을 통해 간략하게나마 transcription start site를 예측하기 위해 deletion study에 사용했던 primer를 가지고 RT-PCR을 해보았습니다. ATG로 부터 -200. -400, -500, -600, -700, -800, -900, -1200, -1600bp 까지.... > >-> luciferase assay+EMSA를 통해 promoter로 작용할 수 있는 부분이 -510bp 부근이라는 결과를 실험을 통해 알 수 있었는데, RT-PCR 결과... product가 모든 곳에서 나옵니다. > >3) 위 문제가 prep.한 RNA내 genomic DNA가 존재해서 일어나는 일이 아닌가 해서, RN>A 추출 후 DNaseⅠ으로 다시 digestion 한 뒤 cleanup 해서 위 두 실험을 동일하게 반복해보았습니다. > >-> 결과, 이전 1)/2) 실험 결과와 똑 같은 data가 나옵니다. > > >왜 이런 결과가 나오는지 많이 생각해봐도 머리가 나빠서 좋은 아이디어를 얻을 수가 없네요. 스쳐가는 의문점이라도 좋으니, 작은 조언이라도 해주셨으면 좋겠습니다. > > >P.S 업로드한 PPT에서 1번 슬라이드는 위 1)번 실험결과를 나타내구요, 2번 슬라이드가 2)번 결과를, 나머지 3/4번 슬라이드가 3)번 결과를 의미합니다.

Primer extension assay는 이전부터 생각하고 있었으나 그다지 필요성을 못느끼고 있습니다. 일단 인트론내 프로모터가 존재하고 실험하는 cell line에서 의미있는 결과만 나와준다면 그걸로 의미있는 것이겠죠... 문제는 RT-PCR이 되는 것 까진 좋은데 왜 나오지 않는 부분이 없냔거죠 ㅡ_ㅡ; Genomic contam.은 Quiagen이랑 Promega에서 판매중인 DNase Set이랑 DNaseⅠ을 각각 사용하여 효율성도 테스트해보았지만, 실제 DNA는 잘 분해되는 것을 확인하였습니다. 제가 RT-PCR을 하는데, 인트론에서 판매중인 Maxim RT-Premix를 사용하고 있습니다. cDNA 만들고 PCR 할 필요없이 RNA+Pcr Primer+D.W만 넣어주면 one-step으로 RT - PCR 까지 다 마쳐지는 거죠. 혹시 이 제품에서 RT에 사용되는 primer가 random hexamer인지 몰라 확인해보았으나, 이 제품에 사용되는 primer는 oligo(dt) & random hexamer 둘다 아니고 PCR에 사용되는 사용자가 넣어주는 primer가 사용된다고 하네요. 그래서 마지막으로 현재는, oligo(dt)를 사용해서 RT만을 따로 한뒤에 PCR을 해서 똑같은 패턴이 나오는지 확인하려고 진행중에 있습니다.

저 같으면 앞서 발표된 논문에서 쓰여진 promoter region 역시 cloning해서 그걸 하나의 positive control로 쓰는게 좋을 듯 싶은데요. 거기에서도 원하시는 결과가 나오는지 아니면 두가지 프로모터부위가 얼마나 activity의 차이를 보이는지 그런 것들 역시 좋은 data라고 생각됩니다.