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질의하신 내용에 답글을 달면서 설명드리겠습니다. >alkaline protease 효소활성 측정 실험을 하려고 하는데.. > >제가 세운 실험 계획은 이러합니다. > >1) 시료를 alkaline protease를 생산하는 균을 분리할 수 있는 배지에 > 배양 시킵니다. > >2) 배양 후 생육이 좋고 큰 halo size를 갖는 것을 1차선별 > >3) 선별한 균을 스트레킹 하여 콜로니를 얻어서 동일 배지에 배양. > >4) 배양한 후 성장과 효소활성이 높은 균주를 액체배지에 진탕배양. > >5) 진탕배양 후 원심분리하여 얻은 상등액을 agar plate에 구멍을 내어 > > 50마이크로리터 씩 분주해 생성된 clear zone이 큰것을 선별 > >6) 선별한 균을 다시 액체배지에 배양하여 시간 단위별로 660nm에서 > 흡광도 측정. > >대충 이러한데 2번에 halo size란게 뭐죠?? --> 일반적으로 protease를 생산하는 균주를 1차로 스크리닝 시에 사용하는 배지는 skim milk가 1.5% 정도 함유된 plate 배지를 사용하게 되는데,이 배지에서 생성된 protease에 의해서 각 콜로니 주위에 상이한 크기의 halo가 생성되는 것을 확인할 수 있습니다. 이때 halo가 커다란 균주를 1차로 선별해서 재차 배양하면 되는 것이구요. 이 방법을 통해서는 단지 protease를 생성하는 균주들 만을 선별하는 것입니다. 따라서 protease가운데서도 목적으로 하는 protease를 생산하는 생산균주를 선별하기 위해서는, 2차로 선별과정을 거쳐야 하는데요..이때 2차 선별시에는 목적이 되는 protease, 즉 여기서는 alkaline protease라고 하셨는데요..이 protease에 대해서 기질이 되는 특정 substrate가 함유된 배지를 사용해 줘야 합니다. 2차 배지를 이용해서 평가를 하게되는 기준이 바로 clear zone이 되겠지요. 2차 선별을 통해서 동정된 균주는 결국 substrate 특이적인 protease를 생성하는 균주가 될 것입니다. >그리고 아가 플레이트에 구멍을 내어 50씩 분주한다고 하는데 > >그럼 클리어 존이 큰 쪽에 액이 남아 있는 것을 따는 건가요?? --> clear zone이 큰 쪽에 남아 있는 액을 따는 것이 아닙니다. 그것은 세포를 침전시킨 후의 상등액이니까..배양액+각종 분비된 효소들만 있는것이구요..결국 균주를 선별하기 위해서는 그 배양액의 침전된 세포들이겠지요.. 따라서 원심분리후 배양액과 침전세포들을 서로 동일하게 표기후 침전세포들을 잘 보관하고 있다가, 배지에서 clear zone확인 후, 생산성이 좋은 세포를 찾아 재배양하시면 되고, 이후에 활성을 측정하면 될듯합니다. >아님 콜로니 형성되서 남아 있나요?? 그리고 agar plate에 배지는 > >맨 위의 배지와 같은 배지를 쓰면 되나요? --> 앞에서도 설명드렸지만 1차 선별시의 plate 배지와 2차 선별시의 palte 배지의 조성을 틀립니다..논문을 확인해 보세요.. > >마지막으로 효소 활성 측정인데 실험 6)으로 끝내면 맞는건가요?? --> 예. 활성 측정하고 끝내면 되겠지만, clear zone 형성하는 균주가 한 두개가 아닐 것이고, 크기가 커다란 것 여러 개를 배양해서 최종적으로 활성을 비교해 보셔서 제일 좋은 균주를 동정하시면 되겠네요. 물론 가장 좋은 균주를 찾는 다는 것에는 기질에 대한 특이성이 가장 좋은 균주를 찾느냐? 아니면 생산성이 좋은 균주를 찾느냐의 문제도 고려해야 할 것입니다. 끝으로 균주가 선별되었으면, 효소를 정제하고, 그 효소의 아미노산서열을 결정하여서, 기존에 학계에 보고된 바 있는 가 확인하여, 신규 효소로 밝혀지면, 균주 자체에 대한 동정도 해보시면 좋을 듯 합니다. > >여러 자료를 가지고 짠 것이라서 궁금한게 많네여... > >가르침 부탁드립니다.