2008-10-03
org.kosen.entty.User@10e09145
오용식(rockeryosi)
- 4
E.coli transformation을 하고 blue/white colony screening을 하였는데요..
분명히 white colony였는데, vector를 추출하여
어느 정도 크기의 insert가 들어갔는지 확인을 하였더니...
대부분이 self-ligation된 vector들 이더라구요..
이거 blue/white colony screening이 제대로 안되는거 같은데..
제대로 할 수 있는 방법 없을까요???
오래 배양하면서 지켜볼 수도 없는 노릇이고...(위성콜로니땜시...)
좋은 방법 있으시면 알려주세요..
도와주세요..^^
- screening
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답변 4
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한재석님의 답변
2008-10-04- 0
self-ligation이 문제라면 backbone vector를 자른 후 phosphatase를 처리하시는게 좋을 듯 싶습니다. 그렇게 하면 background self-ligation을 현저히 줄일 수 있으니까요. 그러면 blue/white 스크리닝을 할 필요도 없을 듯 싶은데요. >E.coli transformation을 하고 blue/white colony screening을 하였는데요.. > >분명히 white colony였는데, vector를 추출하여 > >어느 정도 크기의 insert가 들어갔는지 확인을 하였더니... > >대부분이 self-ligation된 vector들 이더라구요.. > >이거 blue/white colony screening이 제대로 안되는거 같은데.. > >제대로 할 수 있는 방법 없을까요??? > >오래 배양하면서 지켜볼 수도 없는 노릇이고...(위성콜로니땜시...) > >좋은 방법 있으시면 알려주세요.. > >도와주세요..^^ -
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송재민님의 답변
2008-10-04- 0
이론과 실제는 조금씩 차이가 있고 가끔 그런일이 발생하는 것 같습니다. 이렇게 한번 해보세요. 우선 콜로니가 형성되면 플레이트를 4도에 최소한 하루 정도 두세요. 그리고 확실히 화이트로 보이는 것을 골라 이것을 바로 액체배지에 접종하지 마시고 다시 플레이트에 깔아서 블루/화이트 셀렉션을 하세요. 이럴경우 처음 고른 콜로니가 확실하다면 모두 화이트만 뜨겠지요. 그런 후 콜로니를 액체배지에 키워 DNA를 확인해보시면 확율이 높아질 것 입니다. >E.coli transformation을 하고 blue/white colony screening을 하였는데요.. > >분명히 white colony였는데, vector를 추출하여 > >어느 정도 크기의 insert가 들어갔는지 확인을 하였더니... > >대부분이 self-ligation된 vector들 이더라구요.. > >이거 blue/white colony screening이 제대로 안되는거 같은데.. > >제대로 할 수 있는 방법 없을까요??? > >오래 배양하면서 지켜볼 수도 없는 노릇이고...(위성콜로니땜시...) > >좋은 방법 있으시면 알려주세요.. > >도와주세요..^^ -
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오용식님의 답변
2008-10-06- 0
제가 cloning을 하면서 vector의 경우, 각 단계마다 purification을 해주고 있는데... 설명을 하자면.. 제한효소 처리하고 purificarion.. dephosphorylation하고 purification.. 이런식으로요.. 이렇게 일일히 purification을 해주고 다음 반응으로 넘어가는것이 맞을까요?? >E.coli transformation을 하고 blue/white colony screening을 하였는데요.. > >분명히 white colony였는데, vector를 추출하여 > >어느 정도 크기의 insert가 들어갔는지 확인을 하였더니... > >대부분이 self-ligation된 vector들 이더라구요.. > >이거 blue/white colony screening이 제대로 안되는거 같은데.. > >제대로 할 수 있는 방법 없을까요??? > >오래 배양하면서 지켜볼 수도 없는 노릇이고...(위성콜로니땜시...) > >좋은 방법 있으시면 알려주세요.. > >도와주세요..^^ -
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한재석님의 답변
2008-10-07- 0
이때는 그냥 Restriction enzyme을 처리한 직후 바로 phosphatase를 넣고 반응을 시키면 됩니다. 이후 gel purification을 거친 후 ligation을 하면 됩니다. 물론 각 단계마다 purification하면 좋지만 그래도 귀찮고 시간도 걸리고 하니까요, 할 필요 없는 부분에서는 안해도 좋겠지요. >E.coli transformation을 하고 blue/white colony screening을 하였는데요.. > >분명히 white colony였는데, vector를 추출하여 > >어느 정도 크기의 insert가 들어갔는지 확인을 하였더니... > >대부분이 self-ligation된 vector들 이더라구요.. > >이거 blue/white colony screening이 제대로 안되는거 같은데.. > >제대로 할 수 있는 방법 없을까요??? > >오래 배양하면서 지켜볼 수도 없는 노릇이고...(위성콜로니땜시...) > >좋은 방법 있으시면 알려주세요.. > >도와주세요..^^