2008-10-10
org.kosen.entty.User@4321ab8e
최연재(bpmedic)
- 2
안녕하십니까..대학원에서 미생물 쪽으로 공부하고 있는 학생입니다.
실험을 하다가 몇가지 궁금한점이 있어서 이렇게 질문을 해봅니다... 아직 많이 부족한게 많습니다. 많은 조언 부탁드립니다.
혼합미생물이나 장내미생물을 정량하기 위해서 일반적으로 생균수 실험을 하는데.. 아무리 선택배지를 쓴다고 해도 구분하기가 까다롭고 원치 않는 미생물이 많이 자랍니다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 분자생물학적인 방법이 많이 사용되는걸로 알고 있습니다.
그래서 Real time PCR을 이용해서 정량을 하는데.. Standard curve를 만들어 줘야하는 단점이 있습니다.. 그것도 균주마다... 제가 알고 있는데로는 universial primer(16S)와 샘플을 PCR하여서 얻은 산물을 정제하여 competent cell(E.coli)에 형질전환 시켜서 배양하여 plasmid DNA를 추출해서 Dilution해서 Real time PCR을 실시해서 표준곡선을 얻는것으로 알고있습니다.
그런데 왜 plasmid DNA를 가지고 표준곡선을 만드는지? 더욱 간단한 방법은 없는지? 알고싶습니다.
- Real time PCR
- microbiology
- Quantitative
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 2
-
답변
최기섭님의 답변
2008-10-12- 0
>안녕하십니까..대학원에서 미생물 쪽으로 공부하고 있는 학생입니다. >실험을 하다가 몇가지 궁금한점이 있어서 이렇게 질문을 해봅니다... 아직 많이 부족한게 많습니다. 많은 조언 부탁드립니다. >혼합미생물이나 장내미생물을 정량하기 위해서 일반적으로 생균수 실험을 하는데.. 아무리 선택배지를 쓴다고 해도 구분하기가 까다롭고 원치 않는 미생물이 많이 자랍니다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 분자생물학적인 방법이 많이 사용되는걸로 알고 있습니다. >그래서 Real time PCR을 이용해서 정량을 하는데.. Standard curve를 만들어 줘야하는 단점이 있습니다.. 그것도 균주마다... 제가 알고 있는데로는 universial primer(16S)와 샘플을 PCR하여서 얻은 산물을 정제하여 competent cell(E.coli)에 형질전환 시켜서 배양하여 plasmid DNA를 추출해서 Dilution해서 Real time PCR을 실시해서 표준곡선을 얻는것으로 알고있습니다. >그런데 왜 plasmid DNA를 가지고 표준곡선을 만드는지? 더욱 간단한 방법은 없는지? 알고싶습니다. > > 말씀하신대로 plasmid에 cloning을 해서 얻게 되면, real time PCR을 할때 primer의 non specific binding에 따른 반응을 최소화 할 수 있기 때문입니다. 그냥 chromosomal DNA를 사용한다면 일반 PCR에서도 볼 수 있는 원치 않는 band가 증폭되는 현상을 RT PCR에서도 나올 수 있기 때문에 standard curve를 그리기 위한 authentic sample은 cloning하는 것이 좋습니다. 더 간단한 방법은 그냥 genomic DNA를 여러번 실험하고서 in house standard로 사용하는 것인데, 이런 방법은 Standard curve가 시험할때 마다 많이 차이가 나기 때문에 정량적인 방법으로 사용하기에는 곤란합니다. 좋은 결과 있으시길 바랍니다...... -
답변
박수제님의 답변
2008-10-13- 0
>안녕하십니까..대학원에서 미생물 쪽으로 공부하고 있는 학생입니다. >실험을 하다가 몇가지 궁금한점이 있어서 이렇게 질문을 해봅니다... 아직 많이 부족한게 많습니다. 많은 조언 부탁드립니다. >혼합미생물이나 장내미생물을 정량하기 위해서 일반적으로 생균수 실험을 하는데.. 아무리 선택배지를 쓴다고 해도 구분하기가 까다롭고 원치 않는 미생물이 많이 자랍니다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 분자생물학적인 방법이 많이 사용되는걸로 알고 있습니다. >그래서 Real time PCR을 이용해서 정량을 하는데.. Standard curve를 만들어 줘야하는 단점이 있습니다.. 그것도 균주마다... 제가 알고 있는데로는 universial primer(16S)와 샘플을 PCR하여서 얻은 산물을 정제하여 competent cell(E.coli)에 형질전환 시켜서 배양하여 plasmid DNA를 추출해서 Dilution해서 Real time PCR을 실시해서 표준곡선을 얻는것으로 알고있습니다. >그런데 왜 plasmid DNA를 가지고 표준곡선을 만드는지? 더욱 간단한 방법은 없는지? 알고싶습니다. > > qPCR 하시네요. ^^; 저도 많이 했었는데요... 꼭 qPCR시에 절대정량이 필요없으시다면 그냥 하셔도 되지만... 아무래도.. 절대정량이 좋겠죠? std curve를 위해서 chromosomal DNA를 사용해도 되지만, 16S copy는 어떤 microbe를 쓰느냐에 따라서 그 gene copy수가 틀립니다. 하여 정확히 농도와 그 genome size를 알 수 있는 plasmid를 주로 이용하죠. 너무 급할 땐 PCR product를 이용하기도 합니다. 하지만.. 비추죠.. ^^; 먼저 말씀해주신 분이 잡밴드와 관련이다고 하셨는데요. 그 말도 옳습니다. 그러나 만약 실험자가 만든 primer가 너무나도 specific하면 그럴 필요가 없겠지만 말이죠.. 좋은 결과 내세요~ ^_^