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지식나눔

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cloning 할 때

2008-11-04 org.kosen.entty.User@39b7a0ab 임경은(kel3833)
  • 2
cloning 초보입니다..2가지 질문인데요 1.단백질의 full size가 아닌 일부분을 cloning 하려고 합니다. 어떤식으로 fragment를 결정하는 것이 좋을까요?? 원하는 도메인의 앞이나 뒤로 얼마나 아미노산 sequence를 늘리는 것이 좋을까요?? soluble하고 안정한 단백질을 정제 하는데 도움이 될런지 궁금해서요 2.그리고 primer를 20mer로 디자인 했는데요, G+C 함량이 25% 정도로 낮고, Tm이 너무 낮으면 어떻게 해야하나요?? primer 길이를 더 늘려야 하나요, 아니면 insert할 DNA를 더 늘려야하나요?? 질문이 제대로 되었는지 모르겠네요..^^;
  • cloning
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답변 2
  • 답변

    오은정님의 답변

    2008-11-05
    • 0
    >cloning 초보입니다..2가지 질문인데요 > >1.단백질의 full size가 아닌 일부분을 cloning 하려고 합니다. >어떤식으로 fragment를 결정하는 것이 좋을까요?? >원하는 도메인의 앞이나 뒤로 얼마나 아미노산 sequence를 늘리는 것이 좋을까요?? >soluble하고 안정한 단백질을 정제 하는데 도움이 될런지 궁금해서요 > >2.그리고 primer를 20mer로 디자인 했는데요, G+C 함량이 25% 정도로 낮고, Tm이 너무 낮으면 어떻게 해야하나요?? primer 길이를 더 늘려야 하나요, 아니면 insert할 DNA를 더 늘려야하나요?? > >질문이 제대로 되었는지 모르겠네요..^^; 1번질문은 잘 이해가 안갑니다만 target protein의 sequence를 수정하시는건 얼마든지 가능합니다. Solubility를 위하여 deletion도 얼마든지 가능하구요. 문제는 어떤 protein을 목적으로 하시느냐가 관건이겠죠... 하지만 참조하시라고 몇자 적어볼께요. 우선 solubility를 증진시키기 위하여서는 여러가지 tag을 삽입 가능합니다. 여기서 target protein이 어떤것이냐에 따라서 N-term tagging 또는 C-term tagging을 계획하는것이구요. fusion patner는 워낙 많지만 손쉽게 검색하실 수 있을거에요. 정제를 위한 tagging도 마찬가지입니다. 예를 들어서 설명드릴께요, KGF의 경우 N-terminal domain은 bacterial recombinant화할때 Cystein 두분자의 intra-disulfide brdg.에 의하여 solubility 저하를 일으키며, active domain(receptor binding)이 바로 cystein 두분자 뒤쪽에 있어서 inactive form 형성의 원인이 됩니다. 그래서 Amgen등의 회사에서 N-term trucated KGF를 특허로 만들었을 정도니까요. 따라서 이런 protein이라면 N-term tagging 보다는 C-term tagging을 권장하는것이구요... 그래서 case by case가 답이겠네요...그리고 tagging은 짧으면 짧을수록 좋다고 생각합니다. 길어지면 길어질수록 wild type으로부터 멀어지는것이니까요(pI, MW, folding....etc.) 2번질문에 답변 드릴께요 primer 20mer인데 GC contents가 25%면 primer 위치로는 추천하지 않습니다. TM값 낮은것도 물론이거니와, AT conserved sequence에 nonspecific binding할 가능성이 높습니다. 당연히 primer 길이를 늘리시는게 속편합니다. insert DNA라 하시면 무엇을 뜻하는지는 잘 모르겠군요... 부족하다면 다시 질문주세요~
    답변수정
    >cloning 초보입니다..2가지 질문인데요 > >1.단백질의 full size가 아닌 일부분을 cloning 하려고 합니다. >어떤식으로 fragment를 결정하는 것이 좋을까요?? >원하는 도메인의 앞이나 뒤로 얼마나 아미노산 sequence를 늘리는 것이 좋을까요?? >soluble하고 안정한 단백질을 정제 하는데 도움이 될런지 궁금해서요 > >2.그리고 primer를 20mer로 디자인 했는데요, G+C 함량이 25% 정도로 낮고, Tm이 너무 낮으면 어떻게 해야하나요?? primer 길이를 더 늘려야 하나요, 아니면 insert할 DNA를 더 늘려야하나요?? > >질문이 제대로 되었는지 모르겠네요..^^; 1번질문은 잘 이해가 안갑니다만 target protein의 sequence를 수정하시는건 얼마든지 가능합니다. Solubility를 위하여 deletion도 얼마든지 가능하구요. 문제는 어떤 protein을 목적으로 하시느냐가 관건이겠죠... 하지만 참조하시라고 몇자 적어볼께요. 우선 solubility를 증진시키기 위하여서는 여러가지 tag을 삽입 가능합니다. 여기서 target protein이 어떤것이냐에 따라서 N-term tagging 또는 C-term tagging을 계획하는것이구요. fusion patner는 워낙 많지만 손쉽게 검색하실 수 있을거에요. 정제를 위한 tagging도 마찬가지입니다. 예를 들어서 설명드릴께요, KGF의 경우 N-terminal domain은 bacterial recombinant화할때 Cystein 두분자의 intra-disulfide brdg.에 의하여 solubility 저하를 일으키며, active domain(receptor binding)이 바로 cystein 두분자 뒤쪽에 있어서 inactive form 형성의 원인이 됩니다. 그래서 Amgen등의 회사에서 N-term trucated KGF를 특허로 만들었을 정도니까요. 따라서 이런 protein이라면 N-term tagging 보다는 C-term tagging을 권장하는것이구요... 그래서 case by case가 답이겠네요...그리고 tagging은 짧으면 짧을수록 좋다고 생각합니다. 길어지면 길어질수록 wild type으로부터 멀어지는것이니까요(pI, MW, folding....etc.) 2번질문에 답변 드릴께요 primer 20mer인데 GC contents가 25%면 primer 위치로는 추천하지 않습니다. TM값 낮은것도 물론이거니와, AT conserved sequence에 nonspecific binding할 가능성이 높습니다. 당연히 primer 길이를 늘리시는게 속편합니다. insert DNA라 하시면 무엇을 뜻하는지는 잘 모르겠군요... 부족하다면 다시 질문주세요~
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  • 답변

    김은민님의 답변

    2008-11-07
    • 0
    단백질의 full size가 아닌 일부분을 cloning 하려고 합니다. 어떤식으로 fragment를 결정하는 것이 좋을까요?? >>원하는 부분으로 결정하시면 됩니다. 어떤 도메인의 활성을 알고싶다면 그 도메인을 선별하시면 됩니다. 만약 도메인 mapping을 위하신 것이라면, domain 단위로 N-말단에서부터 잘린 fragment와 C-말단에서부터 잘린 fragment를 준비하시면 됩니다. 원하는 도메인의 앞이나 뒤로 얼마나 아미노산 sequence를 늘리는 것이 좋을까요?? >> 당연히 도메인만 선별하는 것이 좋습니다. 앞뒤로 아미노신 sequence를 늘이는 것은 도메인의 특성과 fording에 영향을 미칠수 있기 때문입니다. soluble하고 안정한 단백질을 정제 하는데 도움이 될런지 궁금해서요 >> soluble하고 안정한 단백질을 정제하는데는 실험해보지 않고는 알수 없습니다. 컴퓨터 알고리듬으로 미리 분석해볼순 있으나, 정확히 soluble하다 그렇지 않다고 결정내리시는 것은 금물입니다. bacterial induction을 하실것이라면, His system 과 GST system을 둘다 사용하시는 것을 권합니다. 어떤 단백질은 두 system에서 다른 특성을 갖기도 하니까요. 도움이 되셨으면 합니다.
    답변수정
    단백질의 full size가 아닌 일부분을 cloning 하려고 합니다. 어떤식으로 fragment를 결정하는 것이 좋을까요?? >>원하는 부분으로 결정하시면 됩니다. 어떤 도메인의 활성을 알고싶다면 그 도메인을 선별하시면 됩니다. 만약 도메인 mapping을 위하신 것이라면, domain 단위로 N-말단에서부터 잘린 fragment와 C-말단에서부터 잘린 fragment를 준비하시면 됩니다. 원하는 도메인의 앞이나 뒤로 얼마나 아미노산 sequence를 늘리는 것이 좋을까요?? >> 당연히 도메인만 선별하는 것이 좋습니다. 앞뒤로 아미노신 sequence를 늘이는 것은 도메인의 특성과 fording에 영향을 미칠수 있기 때문입니다. soluble하고 안정한 단백질을 정제 하는데 도움이 될런지 궁금해서요 >> soluble하고 안정한 단백질을 정제하는데는 실험해보지 않고는 알수 없습니다. 컴퓨터 알고리듬으로 미리 분석해볼순 있으나, 정확히 soluble하다 그렇지 않다고 결정내리시는 것은 금물입니다. bacterial induction을 하실것이라면, His system 과 GST system을 둘다 사용하시는 것을 권합니다. 어떤 단백질은 두 system에서 다른 특성을 갖기도 하니까요. 도움이 되셨으면 합니다.
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