2008-12-06
org.kosen.entty.User@5e669021
박주용(p5j8y)
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제가...
pYES2 가지고... transformation을 하려고 하는데요~~
E. coli에서는 electroporation이 되는데...
S. cerevisiae 의 경우는 잘 안되고 있습니다.
프로토콜대로 하고 있는데...
electroporation 으로 하고 있는데...
왜?? 그럴까요?/
S. cerevisiae의 경우 w303a 이고요~
(MATa ade2-1 his3-11,15 leu2-3112 trp1-1 ura3-1 can1-100c)
ura 에대해 셀렉션 마커로... 들어간 것에서는 자라는데...
안 들어간 플레이트에서 플라스미드가 들어갔다면...
자라야하는데... elec 조건이 잘 못 된걸까요??
아니면.. com cell 조건이 잘 못된걸까요??
com cell 조건은 첨부파일에 올리겠습니다.
elec 조건은 다양하게 해봤는데.. 잘 안되네요~
yeast가 E. coli보다 쉽게 된다고 들었는데...
아니면... heat shock 으로 하는것이 나을까요??
논문을 보면... 대체적으로 LiAc 로 하는것으로 나오는데...
세팅하려면.. 시약 및 준비시기가 좀 걸릴것 같아서요...
그리고... heat shock보다 electroporation이 효율적인 부분에서 좋다고 하는데..
아니면.. pYES2의 경우는 heat shock 이 좋은걸까요??
해보신 분들께... 조언 부탁드립니다.
부탁드립니다.
제가 사용하는 BTX ECM630 (electro cell manipulator)에서의
프로토콜로...
1. YPD에서 시드 접종하고
2. 본배양에서 접종해서 OD600 - 1.3~1.5 로 키우라고 했습니다.(500ml)
3. 셀 다운해서 100ml YPD에 2ml sterile 1M HEPES, pH8.0 과 2.5ml 1M DTT
넣고 30도에서 15분간 키워서...다시 500ml 로 DW 넣고
4. 셀 와싱~~
처음은 500ml
250ml 은... DW
20ml 은 sorbitol 순으로 한 후...
0.5ml sorbitol 넣어서... 얼릴 후 사용....
볼륨 40 ul에... 플라스미드 100ng 이하로.. 대략 5ul 이하로...
1.5kv 25uF, 200ohm 으로 했고요...
이조건의 경우는 제가 1.5, 2, 2.5kv 로 바꿔서 해봤습니다.
- yeast
- transporation
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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