2008-12-19
org.kosen.entty.User@56f3c228
전정민(wjdals98)
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안녕하세요..도움을 주셨으면 해서 이렇게 글을 올립니다. 다소 긴 글이 될수도 있을것 같습니다. 꼭 도와주세요~~
제가 논문을 쓰고 있는 도중에 문제가 생겼습니다.
유산균에 trasnformation을 하기 위해서 유산균 shuttle vector(PTRKL2)를 이용해서 먼저 E.coli에 sub-cloning을 하고 electroporation을 이용해서 제가 원하는 유산균에 transformation을 성공했습니다.
shuttle vector에는 Erm+ marker가 있어서 plate나 media 상에 Erm을 넣고 자라는것도 확인을 하였습니다. wild strain은 당연히 Erm+가 깔린 배지에서는 자라지 않았습니다.
제가 유산균에 trasformation한 이유는 원하는 효소 유전자를 cloning해서 transformant를 만들었을때 이 효소 활성이 증가하는지의 여부를 알고 싶었습니다.
그래서 transformant를 만들고 wild랑 비교해서 효소 측정을 해본결과 제가 원하는 결과가 나왔습니다. wild 보다 효소활성이 더 높게 나타났고, 또 효소활성이 없는 wild strain에 효소 유전자를 넣은 trasnformant도 활성이 나타났습니다.
효소측정방법으로 실험한 결과 차이가 났기 때문에 transformation 이 성공한걸로 생각했습니다.
여기서 문제입니다. 제가 PCR 방법으로 확인을 하고 싶어서 DNA prep or plasmid prep을 해봤는데요.. 이상하게 제가 원하는 gene의 primer로 PCR을 하면 아무것도 안나타납니다.
근데, Erm+ primer로 PCR을 하면, size에 맞게 PCR이 떠집니다.
어떻게 증명할 수가 없는데, 제대로 유전자가 들어간거 같기는 하지만, 확인을 못하겠습니다.
왜그런지 이유도 모르겠습니다.
다른 방법으로 확인할 수 있는 방법이 없을까요? 도와주세요...급합니다..ㅠ.ㅠ
- PCR
- plasmid prep
- transformation
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답변 1
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답변
박재영님의 답변
2008-12-20- 0
일단 PCR 컨디션을 다시 잡아야 할것 같네요. 일반적으로 콜로니 PCR을 해서 product가 안나올 경우에 plasmid를 뽑아서 나오는 경우는 많은데 plasmid로 pcr을 해서 안오올 확률은 힘들거든요. 어차피 cloning 할때 amplify한 컨디션으로 돌리면 100% 나오게 마련이니까요. 일단 PCR 컨디션을 다시 한번 잡아보시구요. 아니면 PCR 돌리실때 DMSO 넣고 돌려 보세요 DMSO가 DNA base pairing을 풀어줘서 PCR이 더 잘되게 하는 역할을 하는데 주로 genomic DNA에 사용하기는 하지만 그래도 함 넣고 돌려보세요 PCR mixture에 5% 넣으시면 됩니다. 이건 정말 낮은 확률이긴 한데 그 vector를 구성하고 있는 다른 유전자들에 의해서 enzyme의 activity가 강하게 나오는 것처럼 보일 가능성도 아주 조금을 있을것 같네요. 아니면 그 벡터가 들어감으로 해서 WT보다 host의 phyological condition이 변함 으로해서 enzyme activity에 영향을 줬을수도 있고요. 정확한 내용은 알수 없죠. 이건 제 생각인데요 사용하신 vector를요 empty vector form으로 해서 다시 한번 transformant를 만들어 보세요. 그리고 enzyme activity를 비교해 보시면 그게 vector 영향인지, 그 gene 때문인지 알수 있으실꺼에요. 그렇게 얻으신 데이터는 논문 쓰실때 어차피 control로 그래프에 같이 넣으시면 되니까 손해보시는 장사는 아니죠? 일단 최선은 PCR condition을 잡으셔야 할듯.. denaturation temperature 시간을 좀 길게 하셔보던지.. annealing을 조절해보시던지...해야 할듯